Сэмюел Стернберг - Трещина в мироздании [litres]

Мартин отреагировал с энтузиазмом, когда я рассказала ему об идее сотрудничества с Эммануэль. Он также предложил пригласить в проект Михаэля (Михи) Хаузера, магистранта из Германии, который должен был прибыть в мою лабораторию летом. Я согласилась: лишняя пара рук никогда не помешает. Чем больше я узнавала о загадочном белке, с которым работала Эммануэль, тем больше убеждалась, что в нем было нечто особенное – нечто, что поможет раскрыть самые сложные тайны CRISPR.

Фермент Csn1 называли по-разному, пока летом 2011-го за ним окончательно не закрепилось название Cas9. И хотя уследить за сменами его названия становилось все сложнее по мере того, как я все глубже погружалась в изучение существующей литературы о Cas9, я была уверена в неоспоримой важности этого белка. Работа Родольфа и Филиппа 2007 года показала, что дезактивация гена, кодирующего белок Cas9, нарушает способность S. thermophilus отражать атаки вирусов. Более того, когда Жозиан и Сильвен обнаружили, что геномы фагов разрезаются во время иммунного ответа CRISPR, они также открыли, что дезактивация гена, кодирующего Cas9, не дает CRISPR уничтожить вирусную ДНК. Подобным образом в опытах Эммануэль с S. pyogenes мутации в гене, кодирующем Cas9, приводили к дефектам в выработке молекул РНК CRISPR и в целом вредили работе иммунной системы. Наконец, результаты работы, проведенной Родольфом и Филиппом осенью 2011 года в лаборатории Виргиниюса Шикшниса, предполагали, что cas 9 – единственный известный рабочий cas -ген в системе CRISPR S. thermophilus , абсолютно необходимый для противовирусного ответа.

Чем больше я читала об этом, тем яснее становилось, что белок Cas9, скорее всего, играет ключевую роль на том этапе иммунного ответа систем CRISPR II типа, который связан непосредственно с разрушением ДНК. Это белок был совершенно необходим в бактериях рода Streptococcus , однако казалось разумным, что любой критически важный компонент одной из групп систем II типа будет критически важен и для всех других. Однако какую именно роль играл Cas9, еще только предстояло определить.

Мы с Мартином позвонили Эммануэль по скайпу, чтобы начать строить стратегию наших экспериментов с Cas9. Выбрать момент для этого звонка было непросто, и это лишь подчеркивало организационные сложности нашего сотрудничества. Сама Эммануэль находилась в университете Умео в Северной Швеции, в десяти часовых поясах от Калифорнии, а Кшиштоф Чилински, аспирант, отвечавший за проект ее лаборатории по изучению CRISPR, работал в Венском университете (где раньше располагалась лаборатория Эммануэль). В общем, нам предстояло согласовать работу международной команды: французский профессор в Швеции, польский аспирант в Австрии, а в Беркли – немецкий магистрант, чешский постдок и американский профессор.

Когда удобное для всех время было найдено, мы начали в общих чертах обсуждать предстоящий проект. Мы у себя в лаборатории сначала представляли себе движение к цели весьма прямолинейным: нам нужно понять, как выделить и очистить белок Cas9, – чего пока не смогли сделать в лаборатории Эммануэль. Получив белок Cas9, мы могли бы начать биохимические опыты, чтобы узнать, взаимодействует ли Cas9 с РНК CRISPR (мы предполагали, что да), а также понять, что он делает во время противовирусного иммунного ответа.

Кшиштоф, магистрант Эммануэль, прислал нам искусственную хромосому, содержащую ген cas 9 из S. pyogenes , а Михи принялся за работу над очищением белка под пристальным контролем Мартина. Сначала Михи помещал синтетическую ДНК в различные штаммы E.coli , а затем, варьируя условия роста и типы питательных сред, последовательно проверил десятки различных параметров, чтобы подобрать протокол, при котором получается максимальное количество белка Cas9 (словно садовник, пробующий различные комбинации почв и удобрений, чтобы определить оптимальные условия для роста нового цветка). Затем с помощью хроматографии (эта технология позаимствована из химии) Михи протестировал различные методы “вскрытия” клеток и отделения Cas9 от других клеточных белков. Наконец, он определил стабильность очищенного белка Cas9. Некоторые белки капризнее других и портятся после одного лишь применения – обычно они слипаются друг с другом и выпадают в осадок, подобно микроскопическим снежинкам, из-за чего совершенно прозрачная пробирка с белковым раствором становится молочного цвета. Другие же молекулы демонстрируют замечательную выносливость – например, их можно неоднократно замораживать и размораживать. Нам повезло: Cas9 относился ко второй категории.

Наконец, пришло время провести первый биохимический опыт. Когда Михи и Мартин выделяли и очищали белок Cas9, мы предположили, что проявление любой связанной с разрезанием ДНК активности, свойственной конкретному белку, зависит от наличия РНК CRISPR. В системах CRISPR I типа, которые изучали в нашей лаборатории, РНК CRISPR собиралась вместе с множеством Cas-белков для формирования машины для соединения с ДНК и ее разрезания. Мы предполагали, что Cas9 может работать с РНК CRISPR подобным образом. В соответствии с этой идеей компьютерный анализ последовательности аминокислот Cas9 показал возможное присутствие не одной, а двух отдельных структур для разрезания нуклеиновых кислот, или нуклеаз, внутри фермента. Возможно, один или оба эти участка были способны резать ДНК фага.

Так как время Михи в лаборатории уже подходило к концу (ему нужно было вернуться в Германию, чтобы доделать диссертацию, и билет на самолет был уже куплен), они с Мартином поставили перед собой задачу выяснить, способен ли очищенный фермент Cas9 разрезать ДНК. Синтезировав рабочую молекулу РНК CRISPR, которую идентифицировала Эммануэль во время работы над S. pyogenes , они смешали РНК CRISPR, белок Cas9 и образец ДНК. Что важно, использованная в экспериментах ДНК содержала последовательность “букв”, совпадающих с последовательностью на одном из концов РНК CRISPR.

Как это часто бывает в науке, этот эксперимент обернулся разочарованием. Никаких изменений в ДНК не наблюдалось; после воздействия Cas9 и комплементарной РНК CRISPR она оставалась точно такой же, как и до этого. Либо Михи не выполнил эксперимент с должной аккуратностью, либо Cas9 все-таки был лишен способности разрезать ДНК. Михи представил результаты сотрудникам лаборатории и в несколько подавленном настроении отправился домой, уверенный, что целое лето, занятое сложной работой по выделению, очищению и изучению Cas9, потрачено впустую.

Пока наше сотрудничество с Кшиштофом и Эммануэль еще только набирало обороты, Мартин курировал работу Михи в лаборатории, но также продолжал поиски вакансии преподавателя. Он проходил собеседования по всему миру – в том числе, например, в Швейцарии (где он в конце концов и станет доцентом в Цюрихском университете). Однако, к счастью для нас, к тому моменту, когда Михи отправился домой, график поездок Мартина тоже стал значительно менее напряженным, поэтому он смог продолжить начатое Михи, полностью сосредоточившись на Cas9 – и на поисках ответа на вопрос, в чем именно заключается функция этого белка.