Елена Клещенко - ДНК и её человек [litres]

Получив степень, Кэри Муллис отправился в Канзас, потому что его тогдашняя жена собиралась там учиться в медицинской школе. Теперь он захотел стать писателем, но быстро понял, что для этого ему не хватает жизненного опыта: герои получались плоскими и неубедительными. Пришлось вернуться к наукам о жизни (к счастью для человечества). Муллис нашел работу в медицинской школе. Через два года, после развода с женой, он возвратился в Беркли. Работал в ресторане, затем в Университете Калифорния (Сан-Франциско). А потом попал на семинар о клонировании гена соматостатина, и это так впечатлило его, что он начал искать работу, где требовалось бы синтезировать ДНК.

Такая работа нашлась в компании Cetus. С 1979 г. Муллис работал там, был очень доволен. В то время в Сан-Франциско появилось несколько биотехнологических компаний и научных групп, занимавшихся синтезом ДНК. И в начале 1980-х Муллис, уже будучи руководителем лаборатории, столкнулся с парадоксальной проблемой: у него было слишком много олигонуклеотидов – коротких кусочков ДНК с заданной последовательностью “букв”. Олигонуклеотиды, они же олиги на лабораторном жаргоне, синтезировала специальная машина, купленная в компании Biosearch, и руководитель понял, что эта механизация создает угрозу рабочим местам. Если машина синтезирует за восемь часов столько олигонуклеотидов, сколько сотрудники лаборатории вручную за три недели, зачем нужны сотрудники? Может, их уволить? Муллису эта идея не нравилась, никого увольнять он не хотел и начал размышлять над тем, куда бы применить большое количество коротких цепочек ДНК. Что бы такого сделать с помощью этого неожиданно возникшего ресурса и ловких рабочих рук, желательно с пользой и выгодой для всех?

Итак, майской ночью 1983 г. Кэри Муллис, как обычно, ехал на своей серебристой “хонде” по трассе 128, направляясь из Беркли в Мендосино, в летний домик, где собирался провести выходные. С ним в машине была его девушка Дженнифер Барнетт, химик компании Cetus. (Роман их протекал столь бурно, что в Нобелевской лекции Муллиса о Дженнифер рассказывается едва ли не больше, чем о ПЦР.) Дорога поднималась в горы, вокруг цвели каштаны. Дженнифер спала, Кэри вел машину и думал, куда девать олиги.

В соседней лаборатории под руководством Генри Эрлиха занимались детекцией точечных мутаций в ДНК. Вот, скажем, мутации, которые гарантированно приводят к тяжелому заболеванию или смерти плода (ряд таких мутаций уже был известен). Беременная женщина по какой-то причине беспокоится, есть ли мутация у ее ребенка, если есть – это показание к аборту по страховке. Как бы это выяснить быстро, недорого и с гарантией?

Современная молекулярная диагностика все это умеет: и выделить ДНК плода из крови матери (теперь даже биопсия не нужна!), и прочитать ее определенный участок. Но в 1983 г. это казалось абсолютной утопией. Не так просто было даже получить нужный фрагмент ДНК – то есть были способы, но Кэри Муллис хотел придумать что-то побыстрее и подешевле.

Дано: мы можем синтезировать любой олигонуклеотид. Можем мы синтезировать нуклеотид, комплементарный участку рядом с мутацией, в наличии или отсутствии которой мы хотим убедиться? Нет проблем. А можем мы добавить к ДНК, которую хотим проанализировать, такой олигонуклеотид и ДНК-полимеразу, чтобы та наращивала цепочку ДНК, начиная от олигонуклеотида, совсем как в секвенировании по Сенгеру? (В такой реакции олигонуклеотид называется праймером, или затравкой, потому что с него начинается синтез ДНК.) Только пусть праймер будет вплотную к сайту (точке) мутации, а в смеси будут дидезоксинуклеотидтрифосфаты с радиоактивной меткой – те, которые у Сенгера останавливают синтез цепочки. Это будет как секвенирование одного нуклеотида. (И в самом деле, немного похоже на один цикл некоторых современных методов секвенирования!)

Теоретически мы все это можем. Практически – будут проблемы: на относительно коротком фрагменте ДНК, в несколько тысяч нуклеотидов, это сработало бы, но геном человека длинен, нужный участок короток, его концентрация исчезающе мала, к тому же есть ненулевая вероятность, что в нашем огромном геноме присутствуют другие похожие участки, с которыми может гибридизоваться олигонуклеотид. (Вспомним саузерн-блоттинги Алека Джеффриса: подобрать зонд, который не метил бы в ДНК все подряд, – непростая задача.) И как тогда отличить интересующий нас сигнал от ложного? Жизнь вечно портит самые прекрасные идеи. Ладно, пропустим это и будем думать дальше, как будто проблемы нет.

Но раз олигонуклеотидов у нас много, почему бы не сделать два олигонуклеотида, комплементарные обеим цепям ДНК, по обе стороны от сайта мутации? (Читатели не забыли, что нити ДНК имеют направление, от 5’ – к 3’ – концу, и только в этом направлении полимераза может наращивать цепь? Два таких олигонуклеотида “указывали” бы на возможную мутацию с двух сторон.) И пусть к одному олигу полимераза присоединит дидезоксинуклеотид А, а к другому – дидезоксинуклеотид Т, и мы точно убедимся, что А не заменен на G… не слишком красивая идея, зато простая и осуществимая.

Что может пойти не так? Ну, прежде всего, в образце могут быть обыкновенные свободные нуклеотиды, и ДНК-полимераза, конечно, будет присоединять их, тогда прощай радиоактивный фрагмент определенной длины. Но можно перед анализом обработать образец ферментом – бактериальной щелочной фосфатазой, которая отъест все фосфатные группы от нуклеотидов, и тогда полимеразе не с чем будет работать, кроме тех меченых нуклеотидов, которые добавим мы. Только как ее потом убрать, чтобы она добавленные нуклеотиды не съела? В то время считалось, что щелочную фосфатазу невозможно инактивировать нагреванием, якобы потом она восстанавливает активность (на самом деле инактивировать ее возможно, если не добавлять в раствор цинк, отмечал позднее Кэри Муллис, но хорошо, что я тогда об этом не знал…).

Думаем дальше: а что можно сделать, если не избавляться от обычных нуклеотидов? Пусть полимераза их использует, разрешаем. Пусть она нарастит такие длинные цепочки, какие сможет. А потом слегка нагреем раствор, чтобы двойные цепочки ДНК расплавились и разошлись, и охладим, чтобы к однонитевой ДНК присоединились новые праймеры. Олигов, как мы помним, у нас много, добавим в смесь, сколько не жалко…

Но позвольте, ведь теперь, кроме ДНК образца, у нас появились еще две нити, синтезированные в первой реакции, и каждая из них тоже содержит участок, комплементарный противоположно направленному праймеру. Четыре цепочки ДНК вместо двух изначальных… Стоп! Но это же как раз то самое, что нам было нужно: увеличение концентрации интересующего нас участка ДНК, чтобы он стал заметнее на фоне всей остальной ДНК, которая нас сейчас не интересует.