Елена Клещенко - ДНК и её человек [litres]

За прошедшие десятилетия “версия Соколова – Дитерихса” стала любимым преданием русской зарубежной культуры, и заставить ее сторонников переменить мнение было чрезвычайно трудно. Возьмем фантастический пример: пусть некий историк раздобыл неопровержимые доказательства, что последняя дуэль Пушкина состоялась не у Черной речки. Очевидно, что общественность отвергнет эту версию, даже не взглянув на доказательства. Точно так же отвергает русская зарубежная аристократия (или, по крайней мере, некая влиятельная ее часть) версию “екатеринбургского могильника”.

Частью мифа стали и отрубленные головы, заспиртованные по приказу Кремля. Те, кто пытается примирить старую и современную версии, придумывают замысловатые объяснения: головы были отрублены и позднее возвращены в могилу, или же только черепа там принадлежат царской семье, а прочие останки – совсем другим людям, или, наоборот, найдены тела Романовых, а неизвестно чьи черепа добавлены агентами КГБ… Ни одна из этих версий не выдерживает критики хотя бы потому, что шейные позвонки сохранились неповрежденными.

Можно было понять и ныне живущих родственников царской семьи, и церковных иерархов – цена ошибки высока. И когда были найдены останки последних двух тел, ДНК-идентификацию решили провести повторно, на новом уровне, благо за десятилетие методы получения и анализа ДНК заметно усовершенствовались.

К работе привлекли ведущего специалиста в этой области, Е. И. Рогаева (Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, Медицинская школа университета Массачусетса). Генетической экспертизой екатеринбургских останков занимались параллельно в Идентификационной лаборатории ДНК вооруженных сил США, в Инсбрукском медицинском университете (Австрия) [79] Coble M. D. et al. Mystery Solved: The Identification of the Two Missing Romanov Children Using DNA Analysis // PLoS ONE. 2009; 4 (3), e4838; doi: 10.1371/journal.pone.0004838. , а также в Свердловском областном бюро судмедэкспертиз.

– Я сказал Евгению Ивановичу: важно, чтобы экспертиза была на уровне, характерном для международной юридической практики. Результаты должны быть как минимум настолько достоверны, чтобы на их основании в цивилизованной стране человека могли осудить за уголовное преступление, – рассказывал прокурор-криминалист Генпрокураторы В. Н. Соловьев.

Итак, образцы из второго захоронения с соблюдением всех формальностей передали исследовательской группе, которую возглавлял Евгений Рогаев. Здесь важен был опыт этой группы в работе с древней ДНК – извлеченной из образцов, которые пролежали в земле многие годы.

Это не всегда криминалистика – иногда это археология и палеонтология. Сейчас уже становятся привычными термин “палеогенетика” и сокращение aDNA – ancient DNA, то есть древняя. Все наслышаны о геномах неандертальцев и денисовцев, регулярно появляются результаты все новых исторических изысканий с участием генетиков, в которых изучают не ДНК современных потомков давно умерших людей, а ДНК, извлеченную непосредственно из ископаемых образцов. Читают геномы древних жителей Британских островов и Скандинавского полуострова, древних славян и доколумбовых индейцев. Палеонтологи активно работают с митохондриальными ДНК древних и современных животных – сравнивая их, строят филогенетические древа, определяют, кто от кого произошел.

Последовательность действий при изучении древней ДНК на первый взгляд проста. ДНК выделяют из образцов, проводят амплификацию методом ПЦР (поскольку материала обычно бывает мало, и другого случая исследовать тот же объект, возможно, не будет, часто стараются амплифицировать не только участки, интересующие в данный момент), а затем секвенирование. До появления методов NGS могли секвенировать отдельные гены, которые “вытаскивали” из образца методом гибридизации, либо использовали метод дробовика (shotgun sequencing): ДНК случайным образом расщепляют на фрагменты, потом секвенируют их и состыковывают с помощью компьютерной программы.

Метод дробовика (шотган-секвенирование) сделала популярным компания Крейга Вентера Celera Genomics, использовавшая его в проекте “Геном человека”. Именно с его помощью были прочтены первые геномы организмов. Суть его в получении множества сравнительно коротких фрагментов исследуемой ДНК (метод Сенгера не мог читать более 1000 нуклеотидов за один раз), секвенировании и состыковке с помощью мощного программного обеспечения. Важным преимуществом шотган-секвенирования (по сравнению с методичным клонированием крупных фрагментов, положение которых в геноме и друг относительно друга было известно) стала возможность автоматизации.

На словах все легко, на практике сложности начинаются с выделения ДНК из древних образцов. “Минимум требований – наличие трех комнат: в одной проводится экстракция ДНК, в другой амплификация, в третьей секвенирование. Работать с ДНК современных биологических видов необходимо в отдельном здании или хотя бы в помещении с отдельной вентиляцией, иначе велика вероятность загрязнения. Ранее считалось, что повторение результатов независимой лабораторией – непременное условие публикации, сейчас это ограничение снято” , – рассказывал Евгений Рогаев [80] Рогаев Е. И. Технические проблемы исследования древней ДНК // Химия и жизнь. 2009. № 6. .

Посторонняя ДНК – серьезная проблема, требования к помещениям и вентиляции возникли не на пустом месте. Загрязнителем может быть ДНК того же вида, к которому принадлежит объект исследования (весьма вероятный вариант, если речь идет о человеке) или преобладание ДНК других видов (например, почвенных микроорганизмов). Есть приемы, позволяющие не перепутать “чужую” ДНК с интересующей, однако они не всегда срабатывают. Специалисты помнят забавную (только не для авторов той статьи) историю 1990-х гг.: был опубликован участок митохондриального гена динозавра, жившего 80 млн лет назад [81] Woodward S. R., Weyand N. J., Bunnell M. DNA sequence from Cretaceous period bone fragments // Science. 1994; 266, 5188: 1229–1232; doi: 10.1126/science.7973705. , а потом оказалось, что это человеческий ген. Дело в том, что в ядерной ДНК есть копии митохондриальных генов, накопившие мутации, – так называемые псевдогены, Авторы, конечно, проверили, прежде чем посылать статью в рецензируемый журнал, не похож ли отсеквенированный ими ген на известные митохондриальные гены современных видов, человека в том числе, и сходства не обнаружили, а вот человеческий псевдоген приняли за динозавровый. Но тогда палеогенетика была совсем молодой наукой, практически новорожденной, а с тех пор она шагнула далеко вперед.

Наконец, древняя ДНК может подвергаться химическим модификациям, взаимодействовать с другими органическими веществами. В ней могут происходить так называемые постмортальные мутации, заменяющие С на Т или А на G, и надо уметь это учитывать. Методы для этого есть. Поскольку каждый конкретный участок ДНК в образце обычно представлен как минимум несколькими молекулами, он и прочитывается несколько раз. Маловероятно, чтобы один и тот же аденин был заменен во всех фрагментах, поэтому по результатам секвенирования составляют консенсусную (усредненную) последовательность, имея в виду возможность постмортальных мутаций.