Крейг Вентер - Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии

Большинство людей узнали о геномике при первой расшифровке человеческого генома, которая увенчалась моим появлением в Белом доме в 2000 году рядом с моими коллегами-соперниками и президентом Клинтоном, где мы торжественно объявили об открытии последовательности человеческого генома. На самом деле первые идеи о расшифровке ДНК относятся к временам полувековой давности, когда Уотсон и Крик предложили модель ее атомной структуры. Большой скачок в нашем познании случился, когда в 1965-м группа под руководством Роберта Холли из Корнеллского университета опубликовала последовательность из семидесяти семи рибонуклеотидов аланиновой транспортной РНК (тРНК) из клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae {77} 77 Holley, R. W., G. A. Everett, J. T. Madison, A. Zamir (май 1965). “Nucleotide Sequences In The Yeast Alanine Transfer Ribonucleic Acid.” J. Biol. Chem. 240 (5), стр. 2122–2128. PMID14299636. как часть работы по выявлению того, как тРНК помогает собирать аминокислоты в белки. Секвенирование РНК продолжало лидировать, когда в 1967 году группа Фреда Сэнгера установила последовательность нуклеотидов рибосомальной 5S-РНК E. coli , короткой молекулы из 120 нуклеотидов {78} 78 Brownlee, G. G.; F. Sanger, B. G. Barrell (1967). “Nucleotide sequence of 5S-ribosomal RNA from Escherichia coli .” Nature 215 (5102), стр. 735–736. . Первый реальный геном, который был успешно расшифрован, был вирусной РНК: в 1976 году лабораторией Вальтера Фирса в Гентском университете в Бельгии был секвенирован бактериофаг MS2. Фирс изучал бактериофаги (которые захватывают для своего размножения бактерии) совместно с Робертом Л. Синшаймером из Калтеха, а потом с Харом Гобиндом Кораной в Мэдисоне (Висконсин).

Технология секвенирования ДНК, которая дала мне возможность секвенировать человеческий геном, зародилась в середине 1970-х, когда группа Фреда Сэнгера в Кембридже разработала новую технику – первую, которую можно было назвать «более-менее секвенированием». За ней последовала методика, которую Сэнгер назвал дидезокси-секвенированием ДНК, но которая в его честь теперь называется «секвенированием по Сэнгеру». В нем применяются дидезоксинуклеотиды, или нуклеотиды-терминаторы, которые останавливают ДНК-полимеразу, не давая ей добавлять нуклеотиды к растущей цепочке ДНК. У дидезоксинуклеотидов нет гидроксильной группы (–ОН), что означает, что после того, как ДНК-полимераза прицепит их к растущей нуклеотидной цепочке, дальше нельзя добавить никаких нуклеотидов. Прикрепив радиоактивный фосфат к одному из четырех нуклеотидов, чтобы пометить фрагменты, стало возможным прочесть порядок А, Т, Ц и Г, прикладывая гель, использованный для разделения оснований, к рентгеновской пленке [7] В опытах Сэнгера синтез ДНК с одинаковых матриц шел параллельно в четырех пробирках, в каждой из которых часть нуклеотидов одного из типов (А, Т, Ц или Г) была представлена дидезоксинуклеотидами, меченными радиоактивным фосфором. Присоединение такого нуклеотида обрывало дальнейший синтез. В результате в каждой пробирке получался набор фрагментов ДНК, оборванных в случайном месте (но всегда – по одному и тому же нуклеотиду). Затем все четыре набора подвергались электрофорезу в акриламидном геле, в ходе которого фрагменты распределялись в соответствии со своей длиной: чем короче фрагмент, тем дальше он успевал продвинуться в геле под действием электрического поля. Наконец, все четыре полоски геля выкладывались рядком на рентгеновскую пленку, и по картине распределения меток восстанавливалась последовательность нуклеотидов во всей цепочке. Скажем, самая дальняя метка на пленке оставлена полоской с меченым А – значит, первый нуклеотид в последовательности – А. Следующая по дальности метка оставлена полоской с меченым Ц – значит, второй нуклеотид – Ц. И так до полной расшифровки последовательности. .

Группа Сэнгера использовала его новые инструменты секвенирования для установления первой последовательности генома ДНК-вируса, принадлежащего бактериофагу phi X 174 {79} 79 Sanger, F., G. M. Air, B. G. Barrell, N. L. Brown, A. R. Coulson, C. A. Fiddes, C. A. Hutchinson, P. M. Slocombe, et al. (1977). “Nucleotide sequence of bacteriophage φX174 DNA.” Nature 265 (5596), стр. 687–695. ; эта последовательность была опубликована в Nature в 1977 году. Клайд Хатчинсон (ныне сотрудник Института Вентера) стажировался в лаборатории Сэнгера (от Университета Северной Каролины, где он с 1968 года был штатным преподавателем) и внес свой вклад в секвенирование генома phi X 174 . В 1950-х Синшаймер, использовав рассеяние света, оценил размер генома phi X 174 примерно в 5400 оснований и был удовлетворен, когда Сэнгер выяснил, что точное количество – 5386 {80} 80 http://oralhistories.library.caltech.edu/33/0/OH_Sinsheimer.pdf .

За два года до появления статьи Сэнгера я закончил свою диссертацию в Калифорнийском университете в Сан-Диего ( UCSD ) и успел перейти в Университет штата Нью-Йорк в Баффало, чтобы начать собственную научную и преподавательскую карьеру. Я пропустил публикацию Сэнгера, потому что она вышла в самый разгар Бурана-77 [8] Буран-77 – катастрофическая снежная буря на северо-западе штата Нью-Йорк (где расположен город Баффало) 28 января – 1 февраля 1977 года. Скорость ветра достигала 111 км/час, температура опускалась до –57 °C, толщина снежного покрова местами превышала 2,5 м. Буран парализовал транспортное сообщение и работу электросетей. , к тому же спустя две недели после публикации у меня родился сын {81} 81 Venter, J. Craig (18.10.2007). A Life Decoded: My Genome: My Life . Penguin. E-book. . Моя лаборатория в это время работала над выделением и описанием рецепторов для нейромедиаторов – белков, обеспечивающих передачу сигналов между нервными клетками.

За десять лет, последовавших за работой над геномом phi X 174 , секвенирование ДНК постепенно прогрессировало. Хотя секвенирование по Сэнгеру стало мировым стандартом, оно было медленным, очень трудоемким и требовало заметных количеств радиоактивного фосфора, у которого период полураспада – всего пара недель. Кроме того, чтение гелей с последовательностями было скорее искусством, чем наукой. В своей второй Нобелевской лекции Сэнгер описывал утомительные усилия, которых требовало раннее секвенирование ДНК, и заключал: «Судя по всему, для секвенирования генетического материала был весьма желателен новый подход» {82} 82 Sanger, Frederick, Nobel lecture, 8 декабря 1980. .

В 1984 году я перевел свою исследовательскую команду в Национальный институт здоровья, и мы начали учиться молекулярной биологии с помощью нескольких хороших сборников рецептов по этому предмету и моих взаимодействий с Маршаллом Ниренбергом и его лабораторией, которая располагалась этажом ниже нашей в корпусе 36. За мой первый год в НИЗ мы секвенировали только один ген, адреналинового рецептора человеческого мозга {83} 83 Chung, F. Z., K. U. Lentes, J. Gocayne, M. Fitzgerald, D. Robinson, A. R. Kerlavage, C. M. Fraser, J. C. Venter. “Cloning and sequence analysis of the human brain beta-adrenergic receptor. Evolutionary relationship to rodent and avian beta-receptors and porcine muscarinic receptors.” FEBS Lett, 26 января 1987; 211(2), стр. 200–206. , используя радиоактивное секвенирование по Сэнгеру, но это заняло большую часть года. Как и Сэнгер, я был уверен, что должен быть способ получше. К счастью, это было примерно в то время, когда Лерой Худ и его команда в Калтехе опубликовали ключевую статью с описанием, как они заменили в нуклеотидах-терминаторах радиоактивный фосфат на четыре разных флюоресцентных красителя, которые, если их активировать лазерным лучом, можно было последовательно считывать прямо в компьютер {84} 84 Smith, Lloyd M., Jane Z. Sanders, Robert J. Kaiser, Peter Hughes, Chris Dodd, Charles R. Connell, Cheryl Heiner, Stephen B. H. Kent & Leroy E. Hood. “Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.” Nature 321, стр. 674–679 (12 июня 1986). . Я раздобыл одну из первых автоматических ДНК-секвенирующих машин в новой компании Applied Biosystems , как раз когда начались серьезные обсуждения дикого предложения секвенировать целиком человеческий геном.