Михаил Виленчик - Биологические основы старения и долголетия

Теперь вопрос можно поставить шире: не является ли нарушение структуры, синтеза или распределения топоизомеразы одним из молекулярных механизмов преждевременного старения? И не являются ли возрастные изменения репликации ДНК средством такого нарушения? Дефект репликации ДНК наблюдали в фибробластах людей, страдающих синдромом Вернера или прогерией взрослых (одно из генетически детерминированных заболеваний, обозначаемых и как синдром преждевременного старения). Этот факт свидетельствует о том, что ответ на оба вопроса, наверное, должен быть положительным.

Но как же изменяется способность клеток к репарации ДНК в процессе нормального, физиологического старения? В обширной литературе на рассматриваемую нами тему очень мало работ, освещающих исследования, в которых проблему возрастных изменений репарации ДНК изучали бы на клетках человека, стареющих не in vitro, a in vivo. Хотя "модель" можно исследовать подробнее и с меньшими усилиями, чем само явление, но все же интересно знать, как происходит старение клеток в естественных условиях.

Прежде всего приведу доказательство уменьшения способности к репарации однонитевых разрывов ДНК у фибробластов взрослых людей по сравнению с эмбриональными фибр об ластами. Способность к репарации ДНК эмбриональных диплоидных фибробластов медицинских абортусов и фибробластов, полученных из кожных биопсий здоровых доноров в возрасте от 25 лет до 91 года, А. Н. Хохлов и автор этих строк (работа выполнялась при поддержке Г. Д. Бердышева из КГУ и К. Н. Гринберга из Института медицинской генетики АМН СССР) определяли методом седиментации в градиенте щелочной сахарозы, о котором я уже рассказывал. Результаты, полученные при использовании этой методики, интерпретируются достаточно определенно: повреждение ДНК (радиацией или химическими мутагенами), приводящее к замедлению скорости седиментации ДНК, означает накопление в ней разрывов или других модификаций (щелочно-лабильных связей), которые в щелочной сахарозе трансформируются в разрывы ДНК. Ускорение седиментации ДНК поврежденных клеток в процессе их инкубации при 37 °C интерпретируется как показатель способности клеток устранять повреждения ДНК: в основном однонитевые разрывы и щелочно-лабильные связи.

При отработке условий эксперимента (количество наносимых на градиент клеток, продолжительность их лизиса, скорость центрифугирования) были исключены все возможные артефакты метода. Это позволило максимально увеличить воспроизводимость результатов и установить, что хотя сразу после облучения седиментаграммы ДНК эмбриональных и "взрослых" фибробластов практически одинаковы, в процессе инкубации скорость седиментации ДНК в эмбриональных клетках возрастает несколько быстрее.

Анализ данных многих серий опытов по сравнительному исследованию ДНК эмбриональных и "взрослых" фибробластов при 37 °C показывает, что и за 30 минут, и за 1 час инкубации облученных "взрослых" клеток в их ДНК устраняется; меньше повреждений, чем за тот же промежуток времени в ДНК эмбриональных клеток,

Ранее другими авторами был проведен целый ряд исследований, посвященных изучению изменений способности к репарации различных повреждений ДНК при "старении" in vitro культивируемых диплоидных фибробластов. Эти данные показывают, что репарация индуцированных радиацией однонитевых разрывов и щелочно-лабильных связей нарушается лишь в клетках последних пассажей, когда их жизнеспособность значительно снижена и большая часть клеток в популяции теряет способность к делению.

Другой подход, использованный нами для изучения возрастных изменений репарации ДНК, состоял в сравнении интенсивностей репаративного синтеза ДНК в клетках животных (крыс) различного возраста и в фибробластах человека, культивируемых в течение длительного времени. О результатах, полученных при исследовании спонтанного репаративного синтеза ДНК в клетках головного мозга, было рассказано в предыдущей главе. То были результаты исследования интактных животных.

Но кроме того, в клетках головного мозга взрослых крыс была обнаружена способность к внеплановому синтезу ДНК, индуцированному (вероятно, репаративному) гамма-излучением. Однако когда такие же опыты были поставлены нами на 23-26-месячных крысах, то у них индуцированного излучением внепланового синтеза ДНК обнаружить не удалось. Таким образом, пока мы имеем доказательство способности к обоим репаративным синтезам ДНК — спонтанному и индуцированному — только в нервных клетках головного мозга молодых животных.

Кстати, наличие такой способности заставляет с осторожностью относиться к широко разрекламированным, сенсационным результатам исследований Д. Пейтона и Ф. Нотебома из Рокфеллеровского университета, наблюдавших обмен ДНК в нервных клетках головного мозга взрослых животных (они исследовали канареек) и на основании такого обмена заключивших, что нервные клетки могут разрушаться и замещаться в процессе деления оставшихся. Возможно, однако, что обмен ДНК, исследованный американскими авторами, был обусловлен репаративным синтезом ДНК.

Чтобы выяснить, изменяется ли в процессе старения клеток человека их способность к репарации повреждений ДНК, диплоидные клетки, совершившие различное число делений in vitro, облучали УФ-светом и определяли интенсивность протекающего у них синтеза ДНК, связанного с репарацией повреждений ДНК. Доказательством включения тимидина как следствия внепланового (репаративного) синтеза ДНК являлся, в частности, тот факт, что его интенсивность определялась величиной дозы УФ-облучения. При облучении клеток в относительно небольшой дозе — 25 эрг/мм 2интенсивность репаративного синтеза ДНК в "старых" клетках (40-го пассажа) была статистически достоверно меньше интенсивности репаративного синтеза ДНК в "молодых" клетках (26-го пассажа).

Но конечно, данные, полученные в опытах с клетками, стареющими in vitro, надо осторожно экстраполировать на ситуацию в организме. Поэтому больший интерес представляет вопрос о том, как изменяется репаративный синтез при старении клеток организма. Поскольку, как будет объяснено ниже, это важный для понимания механизмов старения и долголетия вопрос, то основные из имеющихся на этот счет фактов, опубликованных в последние годы (1984–1985), мы теперь рассмотрим.

Е. Ковакс с соавторами из лаборатории генетики человека в Базеле изучили спонтанный и индуцированный УФ-излучением репаративный синтез в лимфоцитах 38 мужчин и 17 женщин, которые были разделены на две группы: 17–39 лет и 44–74 года. Они установили, что интенсивность спонтанного репаративного синтеза ДНК в лимфоцитах людей 1-й группы была меньше, чем в лимфоцитах 2-й. Однако значительных различий в интенсивности индуцированного репаративного синтеза ДНК они не обнаружили, хотя и отметили, что клетки молодых людей менее гетерогенны по этому показателю.