Вячеслав Тарантул - Имя ему СПИД: Четвертый всадник Апокалипсиса

Существенный прогресс в диагностике инфекционных заболеваний, вызываемых нашими невидимыми врагами — микробами, связан с появлением иммунологических методов анализа, создание которых стало возможным после открытия антител. Классические методы иммунохимического анализа, описанные еще в конце XIX в., основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), который появляется в результате формирования высокоспецифических комплексов «антиген-антитело». Наиболее известное достижение в начале XX в. — создание Августом фон Вассерманом в 1906 г. диагностики на сифилис, получившей в дальнейшем название реакции Вассермана, — остается до сих пор самым распространенным тестом в венерологии. Постепенно иммунологические методы совершенствовались, упрощались и в конечном итоге получили широкое распространение в медицинской практике. Детектирование образовавшегося комплекса «антиген-антитело» в растворе стали осуществлять, добавляя в один из исходных компонентов реакционной системы ту или иную «метку», по которой можно следить за ходом реакции. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные (радиоактивные), ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и другие метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.

Нынешний период диагностики характеризуется созданием новых сверхчувствительных методов, расширением их арсенала и внедрением разнообразного медицинского оборудования и компьютерных технологий. Современные иммунохимические методы, основанные на применении «меченых» компонентов, нашли широкое распространение для количественного определения в крови больного биологически активных соединений самой разнообразной структуры — от низкомолекулярных гормонов, онкомаркеров и лекарственных препаратов до высокомолекулярных вирусов, бактерий и даже целых клеток. Основным методом обнаружения антител стал иммуноферментный анализ (сокращенно — ИФА). Этот метод был предложен в начале 70-х гг. прошлого столетия тремя независимыми группами исследователей, работавших в Швеции, Нидерландах и США. Сегодня он стал наиболее часто используемым иммунологическим методом в любых медицинских учреждениях благодаря своей невысокой стоимости и экологической безопасности.

Широкое распространение в последние годы получил революционизирующий метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который по своей чувствительности намного превышает другие современные методы анализа генетического материала.

Первоначально, до того как был открыт ВИЧ, диагноз СПИДа ставили только на основании общей клинической картины. Обнаружение возбудителя заболевания в 1983 г. привело к быстрому развитию специальных методов лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Уже в начале 1985 г. в США была введена обязательная проверка доноров крови на антитела к ВИЧ. А вскоре (в начале 1987 г.) первый анализ на ВИЧ был осуществлен и в России.

Рассмотрим теперь подробнее основные приемы и методы, которые сегодня применяются в практической медицине для установления наличия или отсутствия ВИЧ-инфекции. Обычно для этих целей используют уже готовые диагностические наборы (тест-системы), производимые разными фирмами, которые прошли предварительно очень строгие испытания и получили государственное одобрение на их применение в клинике.

К числу наиболее апробированных и усовершенствованных непрямых методов диагностики ВИЧ-инфекции относится метод, позволяющий обнаруживать в организме не сам ВИЧ, а антитела к его антигенам, которые появляются в крови у ВИЧ-инфицированных пациентов. Иммунная система организма почти сразу реагирует на присутствие чужеродного врага, выпуская против него снаряды-антитела. Вот их-то и пытаются в первую очередь обнаружить медики, используя для этой цели специальные диагностикумы (тест-системы), основанные на так называемом иммуноферментном анализе (сокращенно ИФА). Из названия следует, что в этом анализе используется два типа реакций: иммунологическая и ферментативная.

В настоящее время существует множество вариаций ИФА. Но все они основаны на одной и той же давно уже установленной способности антител специфически взаимодействовать только с «собственными» антигенами, т. е. на иммунологической реакции «антиген-антитело». Наибольшее распространение получил гетерогенный вариант иммуноферментного анализа, при котором антиген (определяемое соединение) или антитела фиксируются на твердой основе, в качестве которой могут выступать полистироловый планшет, полистироловые бусины, пористая подложка или магнитный носитель. Как правило, анализ проводят в три стадии. Схематически эти процедуры изображены на рис. 26. B лунку планшета, содержащую на своих стенках тот или иной антиген (т. е. один из белков вируса), добавляют исследуемый биологический материал, который чаще всего представляет собой сыворотку крови больного. При наличии в организме инфекционного агента в сыворотке появляются антитела к нему (на рисунке обведены). Они прочно связываются с антигеном и не удаляются при последующей промывке чашки. Это первая и основная стадия ИФА. На рисунке антитела изображены в форме «рогатки». И это неслучайно. Как уже указывалось ранее (рис. 2), антитела в действительности устроены как рогатка, из которой мальчишки-хулиганы стреляют куда попало. Только в отличие от рогатки ребячьей антитела строго специфично «стреляют» по мишеням — антигенам, которые их «породили».

Рис. 26. Для проведения ИФА необходимо осуществить несколько операций. (А) На первом этапе к антигену, сорбированному на твердой поверхности (1), добавляют сыворотку крови, содержащую антитело (2). Затем в лунку вносят неспецифические антитела, слитые с ферментом (такой комплекс называют коньюгатом) (3). На конечном этапе (4) в ту же лунку вносят способное окрашиваться вещество — хромоген. Если образуется комплекс-«пирог» (Б), то хромоген под действием фермента расщепляется и появляется окраска. Это означает, что все элементы цепочки присутствуют, «пирог» испекся, и результат тестирования антител положительный

На следующем этапе необходимо определить, образовался или нет в лунке иммунный комплекс, т. е. произошло ли соединение антигена с антителом или не произошло. Невооруженным глазом и даже под микроскопом этого нельзя увидеть. Собственно, для этого и требуются следующие две стадии, которые можно назвать проявляющими. На второй стадии анализа в лунку вносят специальные (реагирующие с разными антителами) антитела с заранее прикрепленным к ним определенный ферментом (отсюда и появляется слово «ферментный» в названии метода ИФА). Слитый в едино комплекс «антитело-фермент» (его называют конъюгатом) способен в свою очередь связаться с антителами человека, уже зацепившимися за антиген, который изначально закреплен на твердой подложке. B результате возникает «молекулярная цепочка», на одном конце которой вирусный белок, а на другом — фермент. После отмывки весь этот многослойный «пирог» остается в лунке планшета. Теперь нужно только обнаружить активность фермента, чтобы сделать вывод о наличии антитела. Для этого на третьей стадии в ту же лунку вносят раствор субстрата и специального бесцветного вещества — хромогена, который способен окрашиваться в результате серии биохимических реакций, осуществляемых присутствующим в лунке ферментом. Если в лунке появляется окраска, это означает, что все элементы цепочки присутствуют, «пирог» испекся.