Николай Курчанов - Генетика человека с основами общей генетики. Учебное пособие

Каждая рестриктаза узнает свою специфичную последовательность. Некоторые рестриктазы дают «липкие концы», другие – «тупые концы», воздействуя на связи, расположенные точно друг против друга. «Тупые концы» можно превратить в «липкие», присоединив искусственно синтезированные последовательности, узнаваемые определенной рестриктазой, – линкеры.Они позволяют клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотносительно к специфичности сайтов рестрикции. Иногда к «тупым концам» присоединяют (при помощи фермента терминальная трансфераза ) комплементарные «хвосты» – поли (А) и поли (Т).

К настоящему времени сконструировано множество типов векторов на основе разнообразных плазмид и вирусов.

Плазмиды являются основным материалом векторов. Геном плазмид представляет собой кольцевую ДНК и имеет систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в бактериальной клетке на определенном уровне. Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам.

На первых этапах генной инженерии применяли естественные плазмиды бактерий. Сейчас создают искусственные (рекомбинантные) плазмиды со стандартными свойствами. Они обычно содержат один сайт рестрикции к какой-либо одной рестриктазе, несут два гена устойчивости к разным антибиотикам и имеют ослабленный контроль репликации. Контроль репликации, свойственный природным плазмидам, ограничивает число плазмид в клетке. Обычно бактериальная клетка имеет 20–30 плазмид, но ослабленный контроль репликации позволяет накапливать в клетке более 1000 плазмид.

Разрыв ДНК плазмиды в сайте рестрикции превращает ее в линейную молекулу. Если той же рестриктазой была разрезана и чужеродная ДНК для выделения нужного гена, то этот ген можно «сшить» с плазмидной ДНК по одинаковым «липким концам» (рис. 7.1).

Рис. 7.1. Плазмида-вектор с встроенной экзогенной ДНК

Полученная гибридная (или химерная) плазмида будет представлять собой рекомбинантную ДНК. Гибридная плазмида может существовать в бактериальной клетке долгое время. Она реплицируется так же, как и исходная плазмида. Обычно встроенная чужеродная ДНК не влияет на свойства бактерий.

Единственные известные в природе эукариотические плазмиды обнаружены у дрожжей. В генной инженерии были «сконструированы» особые плазмиды, способные существовать в клетках как бактерии E. coli , так и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В этом случае один и тот же вектор может быть использован с двумя хозяевами.

Явление переноса генетической информации при помощи вирусов называется трансдукциейи встречается в живой природе.

В генной инженерии наиболее широко применяется фаг ë. ДНК фага представляет собой линейную молекулу, поэтому один разрыв рестриктазой приводит к образованию двух фрагментов. Эти фрагменты сшивают с чужеродной ДНК, в результате чего образуется химерный фаг. Этот фаг должен пройти цикл литической инфекции для накопления достаточного количества встроенной ДНК.

Размер встраиваемой ДНК не должен превышать 10 % генома фага, иначе он не поместится в капсид. Для решения этой проблемыу фага-вектора удаляют часть собственной ДНК, оставляя только необходимые гены.

В последнее время разработаны тонкие методы введения экзогенной ДНК в клетки-реципиенты при помощи микроинъекций.

Экспрессия чужеродного генетического материала в клетке-реципиенте представлялась наиболее трудной задачей на заре становления генной инженерии.

Накопление необходимого количества ДНК, при использовании как вирусных, так и плазмидных векторов происходит в бактериальной клетке-хозяине. Обычно эукариотические гены в бактериальной клетке не экспрессируются. Для преодоления этого барьера разработаны различные подходы.

В последние годы большое значение приобрел новый метод – полимеразная цепная реакция(ПЦР), позволяющий размножить любой интересующий исследователя фрагмент ДНК. Для этого используются специфические праймеры (затравки) длиной 18–20 нуклеотидов и термостойкие ДНК-полимеразы . ПЦР позволяет увеличить количество ДНК любого участка в сотни раз.

Для транскрипции эукариотического гена в бактериальной клетке он должен быть помещен под контроль бактериального промотора. Это достигается встраиванием либо кодирующей последовательности эукариотического гена в структуру оперона (причем рядом с промотором), либо бактериального промотора в вектор.

Для трансляции синтезированной чужеродной м-РНК были сконструированы векторы, в которых сайт рестрикции находится рядом с участком связывания рибосомы (за промотором), а вставка начинается со стартового кодона.

При трансформации эукариот посредством ДНК бактерий необходимо учитывать, что репликаторы бактериальной клетки в эукариотической клетке не работают. Для преодоления этого барьера введенная ДНК должна быть интегрирована с хромосомой, что значительно легче осуществить у микроорганизмов. Хорошую модель такого процесса мы можем наблюдать в природе. Было показано, что причиной опухолей некоторых растений является бактериальная Ti-плазмида длиной около 200 000 п. н. Эти плазмиды проникают в клетки растений, часть ДНК Ti-плазмиды (Т-ДНК) встраивается в хромосомы растений и вызывает образование опухолей, нарушая баланс фитогормонов. С помощью Ti-плазмиды были проведены различные эксперименты на растениях (Инге-Вечтомов С. Г., 1989).

В настоящее время многие барьеры, препятствующие первым исследованиям, преодолены. В бактериальном геноме экспрессируются введенные гены человека (инсулина, интерферона, гормона роста и др.). Успешно вводятся чужие гены, в том числе и человека, в геномы животных. Чужеродный ген, введенный в клетку какого-либо организма, получил название трансгена.Животных, носителей такого гена, называют трансгенными. Генная инженерия породила целую новую индустрию – биотехнологию.

Генная инженерия ведет отсчет своей истории с работы П. Берга по созданию рекомбинантной ДНК вирусного и бактериального геномов в 1972 г. (Berg Р., 1981). За прошедшие 30 с лишним лет произошли изменения, сравнимые с промышленной революцией. Современная жизнь уже немыслима без биотехнологии. Но, как и все крупномасштабные явления, генная инженерия породила немало проблем. Проблемам, поднимаемым генной инженерией, посвящены сотни книг. Поэтому, не вдаваясь в подробности столь многогранной темы, перечислим некоторые «узловые» моменты дискуссий вокруг нее.