Паоло Пелоси - Обоняние [Увлекательное погружение в науку о запахах]

Чтобы расширить знания об этих белках, мы начали изолировать ОСБ других видов животных и оценивать их сродство с рядом сильнопахнущих веществ. У всей этой истории с самого начала было одно слабое место: тот факт, что все ольфакторные данные собирались, очевидно, у людей, а биохимия при этом изучалась на других млекопитающих. Хотя мы могли с известной уверенностью предположить, что у всего этого класса обонятельные системы устроены похожим образом, было бы очень недурно все-таки изучить свойства ОСБ у человека.

Несколько групп параллельно заинтересовались поисками человеческого ОСБ, но все их попытки потерпели крах. После расшифровки последовательности генома человеческий ОСБ был наконец обнаружен – сначала как ген, а затем и как белок, производимый организмом лишь в крайне малых количествах. Этим человек отличается от коров и свиней, из чьих назальных тканей его можно без труда выделить в огромных объемах – вплоть до нескольких миллиграммов с одного животного.

Как только коровий ОСБ был изолирован, мы тут же вплотную занялись его структурой. Прежде всего нужно было определить последовательность его аминокислот. Это маленький белок, с какими-нибудь 150 аминокислотами, но в те времена, когда молекулярно-биологический инструментарий еще не имел широкого лабораторного применения, задача эта была отнюдь не проста. У нас ушел почти полный год на секвенцирование коровьего ОСБ с применением традиционного биохимического метода. Этот белок и с ним свиной ОСБ были одними из последних, секвенцированных таким способом. Очень скоро методы молекулярной биологии, куда более быстрые и дешевые в применении, полностью вытеснили традиционную систему.

Думаю, мне все равно стоит описать здесь биохимический способ секвенцирования белка, совершенно громоздкий и устарелый по сравнению с современными процедурами. С практической точки зрения мы подвергали образец белка серии химических реакций, задача которых состояла в том, чтобы отщипывать от него по одной аминокислоте зараз. Реакция начиналась с аминотерминала (условно рассматриваемого как начало белковой цепочки); далее ее можно было успешно повторять с 20–30 аминокислотами – максимум с 40. Эта последовательность была изобретена Пером Эдманом в 1956 году и с тех пор оставалась неизменной. Представляете, какое блестящее это было открытие? В самом начале процедуру производили мануально – для этого требовались огромные количества изолированного белка; далее ее передали специализированным машинам, состоящим из комбинации насосов и клапанов, – они называются аминокислотными секвенаторами и вполне могут закончить дело за одну ночь.

Однако даже маленький белок в длину все равно превышает 20–30 аминокислот, которые можно секвенцировать напрямую. Получается, чтобы обработать всю цепочку, ее нужно поделить на отрезки специальными ферментами, которые перережут связи в точно определенных местах. Далее, чтобы правильно собрать все фрагменты, нам все равно нужно обработать еще один образец белка – уже другим ферментом, который порежет его в других точках. Эти фрагменты тоже нужно будет изолировать и секвенцировать. Зачем это нужно? Чтобы получить взаимоперекрывающиеся области и суметь потом восстановить всю цепочку белка – примерно как собрать пазл. Как вы уже поняли, процедура получается длинная и требует больших количеств сырья.

Сегодня с применением методов молекулярной биологии весь процесс занимает обычно пару дней. Для самого последнего способа достаточно секвенцировать короткий фрагмент длиной в шесть-десять аминокислот – лучше, если он будет первым в цепочке. Полученная информация позволит воссоздать и синтезировать олигонуклеотид – коротенький сегмент ДНК, содержащий базовую кодировку для данной конкретной последовательности аминокислот. Каждая аминокислота кодируется тройкой нуклеотидов; получается, что ген, кодирующий восемь аминокислот, будет длиной всего в 24 нуклеотида. Такое было нетрудно синтезировать даже на ранних стадиях данной технологии (сейчас мы запросто синтезируем целый ген для небольшого белка длиной в несколько сотен нуклеотидов). Дальше на этот олигонуклеотид ловится изучаемый белок, который затем усиливается. Для этого применяется техника, стремительно ставшая одним из самых популярных лабораторных приемов в области молекулярной биологии. Она называется ПЦР (полимеразной цепной реакцией) и была изобретена Кэри Бэнксом Маллисом в 1983 году – за это выдающееся достижение он десять лет спустя получил Нобелевскую премию по химии.

Идея репликации ДНК (то есть умножения ее объема), безусловно, не нова. Самое интересное свойство ДНК – как раз ее способность создавать собственные копии. Именно благодаря этой реакции существует биологическая жизнь на Земле; именно благодаря ей наследственные характеристики передаются следующим поколениям вида, как предположили еще Уотсон и Крик в своей основополагающей статье в журнале Nature, где описывалась структура ДНК. Это ее свойство основано на комплиментарности четырех нуклеотидов: аденина (A), гуанина (G), цитозина (C) и тимина (T), вместе составляющих молекулу ДНК. Они могут устанавливать относительно прочные и специфичные взаимодействия с использованием водородных связей, где атом водорода, соединенный с кислородом или азотом, может работать мостиком между двумя этими элементами. Интересно, что водородные связи достаточно устойчивы для специфических взаимодействий, но при этом достаточно слабы, чтобы легко рваться, сохраняя структуру молекулы, которая удерживается куда более прочными ковалентными связями – они остаются неуязвимыми.

В процессе репликации отдельные нуклеотиды связываются с молекулой ДНК (которая работает шаблоном) при помощи специфических водородных связей (аденин – с тимином, а гуанин – с цитозином), а ферменты соединяют эти новые строительные элементы друг с другом, словно какая-нибудь швейная машина.

Когда образуется вторая цепочка ДНК, комплиментарная первой, два сегмента можно разделить простым нагреванием смеси. Дальше процесс можно начинать сначала. В процессе ПЦР это достигается сначала повышением температуры до 95 °C (чтобы разделить две цепочки ДНК), затем понижением ее примерно до 50 °C для соединения со специфическими праймерами, затем новым повышением до 72 °C – это так называемая стадия удлинения, когда к растущей цепочке по одному прибавляются нуклеотиды согласно модели, комплиментарной шаблону. Обычно протокол ПЦР включает 30–35 таких циклов. На каждом цикле количество молекул ДНК удваивается. Нетрудно подсчитать, что к концу реакции одна молекула может дать (по крайней мере, в теории) до миллиарда идентичных цепочек ДНК.