Юрий Трусов - Цервицит

Для адекватной интерпретации результатов серодиагностики хламидиоза следует определять такое понятие как “пограничные титры”. Это – наименьшие возможные разведения, в которых тест-системы определяют антитела против хламидии. “Пограничные титры” для IgM – 1:50, IgA – 1:50, IgG – 1:100. Так называемые “диагностические титры” могут подтверждать клинический диагноз, стадию процесса, необходимость назначения антибактериального лечения (табл.1). При реинфекции и реактивации происходит cкачкообразный подъем титров IgG, изменения титра IgA идут параллельно с титром IgM, однако на более низком уровне. У лиц, не получающих в период реинфекции лечения, титр IgG cохраняется на неизменном уровне. Выявление на протяжении длительного периода титра только IgG указывает на состояние реконвалесценции после перенесенной хламидийной инфекции (“серологические шрамы”). Исследуя титры антител IgG, IgA, IgM, можно оценивать эффективность проведенного лечения в отдаленном периоде (через 1−1,5 месяца).

Таблица 1

Диагностический диапазон титров антител IgG, IgA, IgM при хламидиозе

Стадия заболевания

Дипазон титров IgG

Диапазон титров IgA

Диапазон титров Ig M

Первичная/острая

Определяются Ig M

>100−6400

> 50−1600

> 50−3200

Хроническая

Определяются Ig А

>100−1600

>50−200

<50

Реактивация/Реинфекция

Определяются Ig G, IgA

>100−51200

>50−400

<50

Состояние после Реконвалесценции

Определяется IgG

>100−400

<50

<50

Молекулярно – биологические методы – методы на основе амплификации (лат. amplificatio – усиление, увеличение), нуклеиновых кислот: процесс образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК сигнала, мишени и зонда.

При использовании методов амплификации сигнала, в ходе реакции увеличения концентрации мишени или зонда не происходит. Значительное повышение аналитической чувствительности метода достигается за счет связывания с мишенью множества меченых молекул. Один из вариантов этого подхода (hybrid capture assay – метод захвата гибридных молекул) используется в коммерческих тест-системах для выявления C. trachomatis. Метод основан на гибридизации в растворе ДНК-мишени и РНК-зонда. Образовавшиеся гибридные молекулы захватываются иммобилизованными антигибридными антителами. Затем к иммобилизованным гибридным молекулам присоединяются антигибридные антитела, меченные щелочной фосфатазой. Реакция оценивается по интенсивности люминесценции, ее высокая чувствительность определяется тем, что к одной гибридной молекуле (ДНК+РНК) присоединяется множество молекул меченых антител.

Амплификация зонда. При использовании этих методов продукт амплификации представлен только нуклеотидными последовательностями, входящими в состав зонда. Наиболее известным вариантом этого метода является лигазная цепная реакция.

Амплификация мишени. Все методы, относящиеся к этой группе, основаны на проведении энзиматических реакций, в процессе которых один или несколько ферментов синтезируют множественные копии нуклеиновой кислоты – мишени.

Классическая ПЦР. Амплификация ДНК-мишени осуществляется в ходе повторяющихся циклов, каждый из которых включает денатурацию ДНК-мишени при температуре более 900С, отжиг на каждой одноцепочечной молекуле ДНК комплементарного праймера (олигонуклеотида) при понижении температуры до 550С – 650С, достройку двухцепочечной молекулы ДНК с каждого праймера в результате энзиматической активности термостабильной ДНК-полимеразы. По окончании цикла происходит удвоение фрагментов ДНК-мишени. Для детекции продуктов амплификации используются электрофоретический и гибридизационно-флуоресцентный методы.

ПЦР в реальном временипозволяет предотвратить перекрестную контаминацию исследуемых образцов, которая свойственна классической ПЦР, благодаря её высокой чувствительности. Для детекции продуктов амплификации разработаны технологии, основанные на комплексе ферментативных реакций, в результате которых в реакционной смеси возникает флюоресцентный сигнал, по интенсивности пропорциональный количеству образовавшегося продукта амплификации. ПЦР в реальном времени может быть использована для определения количественного содержания ДНК-мишени в биологическом образце.

Методы амплификации, основанные на транскрипции, реализуются при постоянной температуре, а мишенью является РНК хламидий. На начальных этапах реакции при участии обратной транскриптазы на матрице РНК – мишени происходит синтез комплементарной ДНК. Затем с помощью РНК полимеразы синтезируются множественные копии РНК. В настоящее время распространены амплификация, основанная на транскрипции (TMA – Transcription Mediated Amplification) и амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA – Nucleic Acid Sequence Based Amplification), различающиеся происхождением используемых в реакциях ферментов и методами детекции продуктов амплификации.

Метод амплификации со смещением цепочки относится к изотермическим, концептуально сложен, но технически прост в исполнении и наиболее часто используется для детекции не только хламидий, но и гонококков. Следует заметить, что в Скандинавии появились варианты C. trachomatis, у которых в результате мутации отмечено отсутствие участка криптической плазмиды C. trachomatis, являющейся мишенью для данного метода.

Таким образом, для постановки диагноза урогенитальной хламидийной инфекции рекомендуeтся использовать валидные и разрешенные к применению методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) и не рекомендуются использование культурального метода и методов основанных на выявлении антигенов хламидий или антител к ним, экспресс-тесты у постели больного. Наиболее информативным может быть клинический материал, если он получен при наличии клинических признаков заболевания, отсутствии использования лекарственных препаратов местно минимум в течение последних 48 – 72 часов, в середине менструального цикла в дни, когда нет кровянистых выделений.

Если, например, при ПЦР в реальном времени обнаруживается 469 копий / мл и выше, то концентрация хламидий считается диагностически значимой и назначается этиотропная и иммунокорригирующая терапия. В противном случае (при концентрации хламидий 100 – 498 копий / мл ) результат исследования признаётся сомнительным и требуется применение культурального метода. В последнем случае окончательно решается: есть инфицирование хламидиями или нет. При этом скрининговые методы (ИФА, ПИФ) могут выступать при положительной детекции хламидий своеобразными «поставщиками» клинических образцов для дальнейшего исследования МАНК. Последние решают проблему низкой чувствительности культурального метода, но не могут его заменить при определении чувствительности хламидий к антибиотикам.