Дмитрий Складнев - Что может биотехнология?

«Сэр, я вполне согласен с автором статьи в том, что факт способности РНК быть матрицей для синтеза ДНК очень важен для молекулярной биологии и должен привести к практическим результатам. Однако я хотел бы заметить, что термин „теминизм“ вводит в заблуждение. В действительности же образование ДНК на матрице РНК было открыто в нашей лаборатории в 1960 г., и первые результаты этой работы были опубликованы за несколько лет до появления первой статьи д-ра Темина по этому предмету. С тех пор мы подтвердили в широких опытах это явление. Я прилагаю оттиск одной из наших первых статей и список наших статей по этому вопросу.

Искренне Ваш, профессор Гершензон С.»

Письмо профессора было опубликовано журналом, поскольку никто не мог спорить с нашим приоритетом в данной области. Но хотелось бы сделать и одно небольшое пояснение.

Ажиотаж вокруг результатов Темина и Балтимора, которым всего через пять лет вместе с Р. Дальбекко вручили Нобелевскую премию, возник не только потому, что они открыли, или повторили открытие нового биологического явления, а потому, что они выделили новый фермент, чего в лаборатории Гершензона не было сделано, потому что не было такой совершенной техники анализа. Все преимущество американских исследователей сегодня перед миром как раз и заключается в этом техническом совершенстве, превосходном лабораторном оборудовании, которое создают и разрабатывают многочисленные первоклассные фирмы. Ведь тому же Темину тоже десять лет никто не верил, пока он не представил на всеобщее обозрение наработанный им фермент. Фермент, который сделал возможным звонок Поллака Бергу.

С помощью РТ стало легко выделять и нарабатывать отдельные гены. Для этого больше не надо было искать определенный участок ДНК, «вырезать» его с помощью специальных ферментов и т. д. Все стало проще и «наоборот». Необходимо было просто стимулировать ген к работе, в результате чего он нарабатывал большие количества и-РНКовых копий, которые относительно легко выделяются из клетки. А потом с помощью РТ можно было сделать копию гена в виде ДНК. Чтобы не путать эту сделанную человеком ДНКовую копию с обычным геном клеточной ДНК, «копийный» ген стали обозначать к ДНК.

Теперь скажем два слова относительно «плазмиды». Плазмиды представляют собой крохотные ДНКовые колечки, которые могут «размыкаться» ферментами, встраивать новый ген и переносить его; от клетки к клетке. Впервые с плазмидами ученые столкнулись, когда у микроорганизмов была выявлена устойчивость (резистентность) к антибиотикам. Оказалось, что бактериальные плазмиды несут гены, кодирующие синтез белка, разрушающего молекулу антибиотика. Плазмиды свободно плавают в цитоплазме кишечной палочки, перенося между клетками этого микроорганизма, живущего у нас в толстом кишечнике, «оперативную» генетическую информацию. Ген при необходимости можно также «включить» в геном вируса, который, заражая клетку, размножится в ней и даст много копий необходимого нам гена. Собрав эти копии, мы можем «прочитать» ген, то есть расшифровать последовательность нуклеотидов.

Этот процесс получения копий назвали «клонированием». Слово «клон» в родстве со старым шотландским «клан». Так жители суровой Шотландии называли двенадцать родов — Макинтоши, Макговерны, Макклинтоки и т. д., которые вели борьбу не на жизнь, а на смерть за свою независимость от англичан.

Сегодня процесс чтения генов пока невозможно представить себе-без их клонирования. Обычно это делается следующим образом: ген «нарезается» специальными ферментами на кусочки по 300–400 нуклеотидов, после чего они встраиваются в геном фагов. Таким образом, создается «фаговая библиотека», позволяющая наработать достаточное количество генетического материала. Обычно размножение фагов осуществляется в кишечной палочке — «рабочей лошадке» современной биотехнологии. Последнее время это стало возможно делать и с помощью клеток млекопитающих в культуре, но это гораздо дороже, потому что кишечная палочка весьма неприхотливый организм. Ее потребности не сравнить с «запросами» высокоорганизованных клеток млекопитающих. Но кишечная палочка имеет свой недостаток — с ней бывает трудно получить достаточно полноценный по своим функциям человеческий белок.

И последнее, чтобы можно было дальше продолжать наш рассказ о моратории Берга. Мы уже неоднократно говорили: «разрезать» ДНК, «встроить» ген и т. д. А что все это значит?

В 1959 г. Нобелевскую премию получили С. Очоа и А. Корнберг из Стэнфордского университета. Им удалось впервые выделить особые белки, которые могут «сшивать» или «склеивать» нуклеотиды в полимерные цепочки, синтезируя тем самым макромолекулы ДНК.

Один из таких ферментов был выделен из кишечной палочки и назван ДНК-полимераза. ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК. Обратная транскриптаза тоже относится к классу ДНК-полимераз, только синтез при этом осуществляется на матрице РНК. Таким образом ученые получили в свое распоряжение ферменты, сшивающие и полимеризующие ДНК.

Рис. 3. Схема выделения и клонирования гена в клетках кишечной палочки

а) «Вырезание» гена из двуцепочной ДНК

б) «Разрезание» плазмиды и включение в нее чужеродного гена

в) Введение плазмиды с чужим геном в клетку

г) Клонирование гена в делящихся клетках микроорганизма

Однако что делать, если необходимо двуцепочечную спираль ДНК в клетках «разрезать,»? Или, например, в случае мутации, приводящей к появлению неправильной «буквы» в генетическом тексте, эту букву вырезать и заменить на нормальную? В этом помогают ферменты-«рестриктазы», разрезающие цепь ДНК в строго определенном месте (название рестриктаза происходит от того же древнего корня, что и наш глагол «стричь»). Рестриктазы открыл швейцарец В. Арбер в 1970 г. Его дочь Анна потом рассказывала всем: «Мой папа открыл в клетках ножницы, которыми можно стричь ДНК».

В. Арбер работал в Цюрихе с фагами и нашел у них фермент, с помощью которого эти вирусы разрезают хозяйскую ДНК и вставляют в нее свой геном. Американец Г. Смит из университета им. Дж Хопкинса в Балтиморе получил этот фермент в пробирке, а Д. Натанс стал его систематически применять, все трое получили за новый прорыв Нобелевскую премию в 1978 г.

С помощью рестриктаз и сшивающих ДНК ферментов операции на генах стали обычным делом. Не удивительно поэтому, что в 1973 г. у П. Берга из Станфорда созрела идей эксперимента по переносу ракового гена в кишечную, палочку. Эта идея взволновала Поллака, который и позвонил Бергу, чтобы выразить свои сомнения в необходимости такого опасного эксперимента и его правомочности.