Крейг Вентер - Расшифрованная жизнь. Мой геном, моя жизнь

Затем фрагменты пропускают через слой геля, на котором молекулы ДНК под действием электрического поля разделяются в зависимости от размера. Теперь можно прочитать последовательность, поскольку более крупным фрагментам ДНК требуется больше времени для прохождения через гель. Поскольку метки на всех четырех нуклеотидах – C, G, A, T – одинаковы и оставляют одинаковый след в виде черных полосок на рентгеновской пленке, необходимо проводить четыре отдельных эксперимента, по одному на каждую букву кода. После использования ДНК-полимеразы для каждого из четырех нуклеотидов-терминаторов (в одной серии опытов помечены все C, в другой – все G, и так далее), их помещают на четыре соседние дорожки на том же самом геле. Когда фрагменты разделяются, одна дорожка демонстрирует фрагменты ДНК, оканчивающиеся на С, другая – оканчивающиеся на G, и так далее.

Гель высушивают, выдерживают несколько дней на рентгеновской пленке, оставляя четыре параллельные дорожки с черными полосками, потом внимательно изучают пленку, начиная с первой из четырех дорожек. Так и получают искомую последовательность, записывая по порядку каждую следующую букву сотни раз для каждого образца. Это трудоемкий и длительный процесс, в течение которого могут происходить – и происходят – всяческие сбои. Если одна из четырех реакций на геле не получилась, весь эксперимент идет насмарку; нередко случается, что дорожки располагаются не параллельно друг другу. Это затрудняет сравнивание черных меток и пробелов на каждой из дорожек и считывание всей последовательности. При высыхании гель может растрескаться, и часто именно так и происходит. Реагенты могут разлагаться, и это тоже часто у нас случалось…

Меня очень раздражала возможность различной интерпретации результатов – я часто видел, как выводы делались не столько на основании полученных данных, сколько в силу авторитета или в интересах какого-нибудь ученого. Я же хотел получить истинные данные, основанные на эксперименте. Последовательность либо есть, либо ее нет. Она либо точна, в пределах погрешностей метода, либо нет – как правило, в результате неряшливости опыта.

После многих недель напряженной работы мы смогли получить клон кДНК для адреналинового рецептора мозга человека. Наше возбуждение достигло предела, когда мы поняли, что эта последовательность значительно отличается от последовательности рецептора индюшки. Мы почувствовали себя на пороге первого большого успеха.

Но как только мы определили последние участки последовательности, стало ясно, что работу мы не закончили: нам недоставало начального участка, то есть точки, на которой у ДНК обычно расположен генетический эквивалент знака препинания. Как уже упоминалось, только небольшой процент нашей ДНК представляет собой гены, кодирующие белки. Чтобы помочь молекулярному механизму клетки их различать, существуют генетические эквиваленты прописных букв и точек.

В любом тексте предложение начинается с заглавной буквы. Так и у большинства генов начало кодирующей белок области ДНК начинается так называемым стартовым кодоном ATG (кодирующим аминокислоту метионин). И точно так же, как заглавные буквы часто встречаются и в середине предложения, в середине гена может появиться кодон метионина. Поэтому необходима дополнительная информация – действительно ли ATG отмечает истинное начало гена. Можно, например, поискать ближайший стопкодон, одну из молекулярных «точек» на концах «предложений» ДНК, которые указывают молекулярному механизму на прекращение синтеза белка.

Поскольку у нас имелся только один сегмент ДНК из библиотеки ДНК мозга, соответствующей адреналиновому рецептору, для определения остальной части гена нам нужна была другая библиотека. Единственным выходом было изготовить из последовательности вблизи недостающего участка радиоактивный зонд и с его помощью найти во второй библиотеке участок с недостающим концом гена.

Наши попытки опять были похожи на поиски иголки в стоге сена, хотя на этот раз количество изучаемых ДНК было меньше. Во второй геномной библиотеке ДНК длина фрагментов в среднем составляла 18 тысяч пар оснований, и каждый из этих фрагментов (клонов) представлял лишь 0,0006 % из 3 миллиардов букв генома. Вместо поиска одного клона среди миллионов мы искали один из приблизительно 167 тысяч клонов. Через пару недель у нас появилось несколько перспективных версий. У одного клона длиной в 18 тысяч букв явно обнаруживался конец гена, поэтому мы приступили к его секвенированию.

План сработал. Наконец-то мы собрали всю последовательность генов с помощью компьютера и написали первую в моей жизни статью по молекулярной биологии {16} 16 Chung F. Z., Lentes K. U. et al. «Cloning and Sequence Analysis of the Human Brain Beta-Adrenergic Receptor: Evolutionary Relationship to Rodent and Avian Beta-Receptors and Porcine Muscarinic Receptors», FEBS Lett. 211, 200–6, 1987. . Мы послали ее в FEBS Letters (журнал Федерации европейских биохимических обществ) – я был знаком с его редактором Джорджио Семенца, и он обещал ее быстро опубликовать. Вскоре нам удалось получить последовательность первого гена адреналинового нейротрансмиттерного рецептора мозга человека. Мы прекрасно понимали, что впереди у нас еще много работы – начиная с очистки рецепторных белков до разработки методики считывания кода, но чувствовали, что сделали нечто очень важное.

Увидеть своими глазами последовательность ДНК, которая до сих пор существовала лишь в воображении, было поразительно, – вроде как выйти на яркий солнечный свет из пещерной темноты. Даже сегодня мне кажется невероятным увидеть молекулярные коды с помощью столь несложной технологии. Та статья стала поворотным пунктом в моей карьере: вместе с командой единомышленников я вступил в новую область науки – молекулярную биологию. И мы были готовы совершить новый рывок.

Я понимал, что определение последовательности гена или белка – только первый шаг к пониманию того, как работает адреналин. Завершение этого этапа означало всего лишь начало следующих. Например, можно было внедрить ген рецептора человека в клетки мышей, культивировать их, начать массовое производство рецепторов и использовать их в самых различных экспериментах. Следовало получить намного больше последовательностей для продолжения работы над нашим открытием – ведь мы поняли, что различные рецепторы нейротрансмиттеров взаимодействуют с одним и тем же антителом. Чтобы подтвердить наше предположение об их общем эволюционном происхождении, нужно было сравнить последовательности большого числа рецепторов. Попытки прочитать ДНК нескольких рецепторных генов оказались первым, пусть и неосознанным, шагом в новую, тогда еще не существовавшую область науки – геномику.