Крейг Вентер - Расшифрованная жизнь. Мой геном, моя жизнь

При воспроизведении гены материнского организма часто, но не всегда, передаются потомству. Чем дальше друг от друга расположены гены на хромосоме, тем меньше вероятность, что такая передача произойдет. Изучая частоту совместной передачи двух генов из поколения в поколение, ученые могут оценить, насколько близко на хромосоме они расположены, и создать карту сцепления. Впервые хромосома была картирована таким образом в начале 1990-х великим американцем Томасом Хантом Морганом при исследовании плодовой мушки. В его честь был назван участок гена, состоящий из около одного миллиона пар оснований генетического кода – сантиморган. О карте с таким разрешением генетики давно мечтали.

Другой вид генетических карт – физическая карта, основанная на поиске физического местоположения данного гена. Определяется, на какой хромосоме находится ген, с чем соседствует, и в каком именно участке хромосомы находится.

Но я не собирался создавать ни карту сцепления, ни физическую карту до секвенирования, как это сделали мои конкуренты. Команда Фреда Блаттнера потратила три года на разработку карты клона лямбды E. coli , и конечным результатом их работы стали 18 перекрывающихся килобаз клонов, подобных сцепляющимся друг с другом элементам игры «Лего», – грандиозный подвиг традиционного генетического исследования. Но у меня не было необходимости создавать такую карту. Каждый, кто хоть раз собирал пазл, знает, что можно продолжать сборку, не зная всей картинки, если идти от краев и других узнаваемых частей снизу вверх. В общем-то, последовательность ДНК сама является конечной физической картой, в которой все пары оснований генетического кода известны, так же как и точный порядок их расположения.

Не имея карты генома H. influenzae , мы разработали несколько принципиально новых методов организации больших совокупностей фрагментов для воссоздания генома. В одном случае для копирования ДНК из генома мы использовали технологию ПЦР. Два химических соединения, так называемых праймера, определяют начало и конец копируемого участка. Мы использовали праймеры, полученные из последовательностей вблизи концов собранных фрагментов. Затем мы попытались использовать ПЦР со всеми комбинациями праймеров с помощью зонда ПЦР от конца каждой последовательности, поочередно со всеми другими зондами ПЦР от концов всех остальных участков.

Получив из генома фрагмент ДНК, мы его быстро секвенировали. Затем мы соединяли в последовательность два других фрагмента. Проделывая одновременно несколько комбинаций, мы могли относительно быстро составить бóльшую часть генома.

Метод ПЦР не работает с каждой точкой геномного разрыва, поэтому я придумал совершенно новую методику секвенирования генома человека. Собрав с максимальной точностью, по специальной компьютерной программе полный комплект из 25 тысяч фрагментов генома Haemophilus , мы в результате получили большие наборы перекрывающихся фрагментов ДНК, так называемые «контиги» (от «contiguous» – «перекрывающиеся»). Чтобы использовать контиги для сборки генома, я планировал сравнивать оба конца нескольких сотен случайных клонов фага лямбда. Если конец одного клона лямбды соответствует одному контигу, а другой конец – другому контигу, то это означает, что мы автоматически определили правильный порядок и ориентацию этих контигов. Нам нужно было разработать новые методы секвенирования только концов клонов лямбды, но это можно было сделать довольно быстро. Получив всего несколько последовательностей со спаренными концами, мы уже могли соединить ансамбли ДНК в правильном порядке. Эта стратегия «секвенирования спаренных концов», предполагающая знание точного количества участков, разделяющих два элемента генетической головоломки, и стала ключом к секвенированию всего генома методом дробовика. Итак, секвенирование свелось всего лишь к заполнению нескольких разрывов во всем геноме бактерии, и мы убедились, что нашли оптимальную методику.

Вскоре должна была состояться конференция по секвенированию геномов, на которой я хотел представить наши результаты. Мы очень гордились достигнутыми успехами, и я с нетерпением ждал открытия конференции. Мы прошли долгий путь, начав с тестирования сумасбродной идеи, и теперь стояли на пороге прорыва, впервые в истории секвенировав геном свободноживущего организма.

В сентябре того же года Роберт Флейшман представил наши результаты на Конференции по секвенированию генома в Хилтон-Хеде в Южной Калифорнии. Нам казалось, что презентация прошла очень хорошо, и мы были буквально поражены, когда выступил Уотерстон и назвал наш метод бесполезным. Он утверждал, что метод никогда не будет работать и наш единственный результат – 11 фрагментов, которые никоим образом не упорядочить. Хэм расстроился больше всех. Он и по сей день не может забыть скандальное выступление Уотерстона в 1994 году.

Вскоре после возвращения в Роквилл мы получили ожидаемый ответ по поводу нашей с Хэмом грантовой заявки на исследование Haemophilus , поданной в начале года. Оценка экспертов была невысокая, и до вопросов финансирования дело даже не дошло. Заключение рецензентов отражало мнение геномного сообщества: как и Уотерстон, все они считали наш метод (к тому же применяемый без их ведома) бесперспективным, а попытки его использовать – бессмысленными. Правда, меня несколько утешило особое мнение небольшой группы независимых экспертов НИЗ, которые выразили несогласие с мнением большинства и посчитали нашу программу достойной финансирования.

Я прикрепил письмо с отказом в финансировании на дверь своего кабинета. Тогда я уже не сомневался, что у нас все получится. Мы с Хэмом решили напрямую обратиться к Фрэнсису Коллинзу с просьбой финансировать проект, представив данные о наших последних результатах, из которых следовало, что в самое ближайшее время мы, скорее всего, расшифруем первый в истории геном. Разумеется, на карту было поставлено нечто большее, чем просто научные достижения. Мы были потрясены, получив через несколько недель письмо из Центра генома НИЗ с отказом.

Однако это письмо нисколько не охладило наш пыл, а побудило продемонстрировать, как ошибаются наши критики. Для этого мы вскоре ликвидировали последние разрывы в последовательности Haemophilus influenzae. Итак, мы первыми секвенировали генетический код свободноживущего организма, и, что было не менее важно, сделали это, разработав принципиально новый метод. Это «секвенирование всего генома методом дробовика» позволило нам быстро (в двадцать раз быстрее, чем любым другим методом) и без геномной карты секвенировать и реконструировать с помощью компьютера весь геном. Конечно, мы очень многим были обязаны Сенгеру, но наш метод обладал важными отличиями. Секвенированные Сенгером в его пионерском исследовании вирусы отнюдь не являлись живыми организмами, а представляли собой сложные химические структуры, которые ведут себя по-пиратски и воспроизводятся только в клетках другого существа. Сенгер разбил геномы вирусов на определенные участки с помощью ферментов рестрикции, поэтому его метод дробовика не был в полной мере случайным. И хотя Сенгер тоже использовал компьютеры, их программное обеспечение не смогло бы «переварить» получаемый нами объем данных.