Крейг Вентер - Расшифрованная жизнь. Мой геном, моя жизнь

Мы всерьез взялись за секвенирование генома дрозофилы 8 апреля, примерно тогда, когда уже должны были завершить эту работу. Я, конечно, понимал, что Уайт хочет от меня избавиться, но делал все от меня зависящее ради выполнения главной задачи. Напряжение и беспокойство преследовали меня и дома, но с самым своим «доверенным лицом» я эти проблемы обсуждать не мог. Клэр откровенно демонстрировала свое презрение, видя, насколько я поглощен делами Celera . Ей казалось, что я повторяю те же ошибки, которые делал, работая в TIGR/ HGS . К 1 июля я чувствовал себя глубоко подавленным, как это уже было во Вьетнаме.

Поскольку конвейерный метод пока у нас не работал, нам предстоял тяжелый изнурительный труд – заново «склеивать» фрагменты генома. Чтобы обнаруживать совпадения и не отвлекаться на повторы, Джин Майерс предложил алгоритм на основе ключевого принципа моего варианта метода дробовика: секвенировать оба конца всех полученных клонов. Поскольку Хэм получал клоны трех точно известных размеров, мы знали, что две концевые последовательности находятся на строго определенном расстоянии друг от друга. Как и прежде, этот способ «нахождения пары» даст нам прекрасную возможность снова собрать геном.

Но поскольку каждый конец последовательности секвенировался отдельно, для обеспечения четкой работы этого метода сборки нужно было вести тщательный учет – для абсолютной уверенности, что мы смогли правильно соединить все пары концевых последовательностей: ведь если хотя бы одна из ста попыток приведет к ошибке и не найдется соответствующая пара для последовательности, все пойдет насмарку и метод не сработает. Один из способов избежать этого – использование штрих-кода и датчиков для отслеживания каждого этапа процесса. Но в начале работы у лаборантов не было необходимого программного обеспечения и оборудования для секвенирования, поэтому приходилось делать все вручную. В Celera небольшая команда, менее двадцати человек, каждый день обрабатывала рекордное количество клонов – 200 тысяч. Мы могли предвидеть некоторые ошибки, например неправильное прочтение данных из 384 лунок, а затем использовать компьютер для нахождения явно ошибочной операции и исправить положение. Конечно, еще оставались отдельные недочеты, но это только подтверждало мастерство команды и уверенность, что мы можем устранять ошибки.

Несмотря на все сложности, мы сумели за четыре месяца прочесть 3156 миллионов последовательностей, всего около 1,76 миллиарда нуклеотидных пар, содержащихся между концами 1,51 миллиона клонов ДНК. Теперь настала очередь Джина Майерса, его команды и нашего компьютера – нужно было сложить все участки вместе в хромосомы дрозофилы. Чем длиннее становились участки, тем менее точным оказывалось секвенирование. В случае дрозофилы последовательности насчитывали в среднем 551 нуклеотидную пару, и средняя точность была 99,5 %. Если иметь 500-буквенные последовательности, почти любой может определить места совпадений, передвигая одну последовательность вдоль другой до тех пор, пока не обнаружатся совпадения.

Для секвенирования Haemophilus influenzae у нас было 26 тысяч последовательностей. Для сравнения каждой из них со всеми остальными потребовалось бы проделать 26 тысяч сравнений в квадрате, или 676 миллионов. Геном дрозофилы, с его 3,156 миллиона прочтений потребовал бы около 9,9 триллиона сравнений. В случае человека и мыши, где мы произвели 26 миллионов прочтений последовательности, требовалось около 680 триллионов сравнения. Поэтому не вызывает удивления, что большинство ученых весьма скептически относились к возможному успеху этого метода.

Хотя Майерс и обещал все наладить, у него постоянно возникали сомнения. Теперь он работал дни и ночи напролет, выглядел измученным и как-то посерел. К тому же у него были проблемы в семье, и он стал большую часть свободного времени проводить с журналистом Джеймсом Шривом, который писал о нашем проекте и как тень следил за ходом исследований. Пытаясь как-то отвлечь Джина, я взял его с собой на Карибы – расслабиться и походить под парусом на моей яхте. Но и там он часами сидел, скрючившись над ноутбуком, нахмурив черные брови и щуря свои черные глаза от яркого солнца. И, несмотря на невероятные трудности, Джин и его команда сумели за полгода сгенерировать более полумиллиона строк компьютерного кода для нового ассемблера.

Если бы результаты секвенирования были стопроцентно точными, без повторяющихся ДНК, сборка генома была бы относительно несложной задачей. Но в реальности геномы содержат большое количество повторяющихся ДНК разного типа, разной длины и частоты. С короткими повторами, состоящими из менее пяти сотен пар нуклеотидов, справиться относительно легко, с более длинными повторами – сложнее. Для решения этой проблемы мы использовали метод «нахождения пары», то есть секвенировали оба конца каждого клона и получали клоны разной длины для обеспечения максимального количества совпадений.

Алгоритмы, закодированные в полумиллионе строк компьютерного кода команды Джина, предполагали поэтапный сценарий – от самых «безвредных» действий, например простого перекрывания двух последовательностей, до более сложных, например использования обнаруженных пар для слияния островков перекрывшихся последовательностей. Это было похоже на сложение головоломки, когда небольшие островки собранных участков составляются вместе и образуют бо́льшие острова, а затем весь процесс повторяется снова. Только вот в нашей головоломке было 27 миллионов фрагментов. И было очень важно, чтобы участки брались из последовательности высокого качества сборки: представьте себе, что будет, если вы собираете пазл, а цвета или изображения его элементов нечеткие и размытые. Для дальнего порядка последовательности генома значительная доля прочтений должна быть в виде совпадающих пар. Учитывая, что результаты все еще отслеживались вручную, мы с облегчением обнаружили, что 70 % имевшихся у нас последовательностей именно такие. Специалисты по компьютерному моделированию объяснили, что при меньшем проценте собрать нашего «шалтая-болтая» было бы невозможно.

И теперь мы смогли использовать ассемблер Celera для секвенирования последовательности: на первом этапе результаты корректировались для достижения самой высокой точности; на втором этапе программа Screener удаляла загрязняющие последовательности из ДНК плазмиды или E. coli . Процесс сборки может быть нарушен всего-навсего какими-то 10 парами оснований «чужой» последовательности. На третьем этапе программа Screener проверяла каждый фрагмент на соответствие известным повторяющимся последовательностям в геноме плодовой мушки – данным Джерри Рубина, который их «любезно» нам предоставил. Местоположение повторов с частично перекрывающимися участками записывалось. На четвертом этапе другая программа ( Overlapper ) обнаруживала перекрывающиеся участки, сравнивая каждый фрагмент со всеми остальными, – колоссальный эксперимент по обработке огромного объема числовых данных. Ежесекундно мы сравнивали 32 миллиона фрагментов с целью обнаружить по крайней мере 40 перекрывающихся пар оснований с менее 6 % различий. При обнаружении двух перекрывающихся участков мы объединяли их в больший фрагмент, так называемый «контиг» – набор перекрывающихся фрагментов.