Николай Лемеза - Альгология и микология. Практикум

Материал, подлежащий фиксации, помещают в чисто вымытую и высушенную стеклянную посуду (пробирки, бутылки, баночки), плотно закрытую корковыми или резиновыми пробками. Водные пробы фиксируют 40%-м формальдегидом, приливая его в количестве 0,1 от объема собранной пробы. Водоросли, находящиеся на твердом субстрате (бумажные фильтры, галька, пустые раковины моллюсков и т.д.), заливают 4%-м раствором формальдегида. Хорошую сохранность водорослей и их окраски обеспечивает также раствор формальдегида и хромовых квасцов (5 мл 4%-го формальдегида и 10 г K 2SO 4· Cr 2(SO 4) 3· 24 Н 2O в 500 мл воды). В полевых условиях можно также использовать раствор йода с иодидом калия. Раствор готовится следующим образом: 10 г KI растворяют в 100 мл воды, добавляют 3 г кристаллического иода и 100 мл воды, встряхивают до полного растворения кристаллов, хранят в темной склянке в течение нескольких месяцев. Его добавляют к пробе в соотношении 1:5. Герметически закупоренные фиксированные пробы можно хранить в темном прохладном месте в течение длительного времени.

Собранные пробы тщательно этикетируют. На этикетках, заполняемых простым карандашом, указывают номер пробы, время и место сбора, орудие сбора и фамилию сборщика. Эти же данные фиксируют и в полевом дневнике, в который, кроме того, заносят результаты измерений pH, температуры воды и воздуха, схематический рисунок, подробное описание исследуемого водоема, развивающейся в нем высшей водной растительности и другие наблюдения.

Качественное изучение собранного материала. Материал предварительно просматривают под микроскопом в живом состоянии в день сбора, чтобы отметить качественное состояние водорослей до наступления изменений, вызванных хранением живого материала или фиксацией проб (образование репродуктивных клеток, колоний, потеря жгутиков и подвижности и т.д.). В дальнейшем его изучают параллельно в живом и фиксированном состоянии.

Работа с живым материалом является необходимым условием успешного изучения преобладающего большинства водорослей, изменяющих форму тела, форму и окраску хроматофоров, теряющих жгутики, подвижность или даже полностью разрушающихся при фиксации. Чтобы сохранить собранный материал живым, его следует оберегать от перегрева, загрязнения фиксаторами, а изучение проводить как можно быстрее.

Водоросли в живом состоянии в зависимости от размеров и других особенностей изучают с помощью бинокулярной стереоскопической лупы (МБС-1) или световых микроскопов.

Для микроскопического изучения водорослей готовят препараты: на предметное стекло наносят каплю исследуемой жидкости и накрывают ее покровным стеклом. Если водоросли обитают вне воды, их помещают в каплю водопроводной воды или оводненного глицерина. Следует помнить, что при длительном изучении препарата жидкость под покровным стеклом постепенно высыхает и время от времени ее необходимо добавлять. Для уменьшения испарения по краям покровного стекла наносят тонкий слой парафина или лак для ногтей.

При необходимости длительных наблюдений над одним и тем же объектом хороший результат дает метод висячей кати. На чистое покровное стекло наносят маленькую каплю исследуемой жидкости, после чего покровное стекло, края которого покрыты парафином, парафиновым маслом или вазелином, накладывают каплей вниз на специальное предметное стекло с лункой посередине так, чтобы капля не касалась дна лунки. Такой препарат можно изучать в течение нескольких месяцев, сохраняя его в перерывах между работой во влажной камере.

При изучении водорослей, имеющих монадную структуру, серьезной помехой служит их подвижность. Однако при подсыхании препарата движение постепенно замедляется и приостанавливается. Замедлению движения способствует также осторожное нагревание препарата или добавление вишневого клея. Подвижные водоросли рекомендуется фиксировать парами оксида осмия (при этом хорошо сохраняются жгутики), кристаллического иода (фиксация парами иода позволяет не только сохранить жгутики, но и окрасить крахмал, если он есть, в синий цвет, что имеет диагностическое значение), 4%-го формальдегида, слабым раствором хлоралгидрата или хлороформа. Длительность экспозиции над парами фиксаторов устанавливают экспериментально, в зависимости от специфики объекта. Наиболее удобны для изучения слабофиксированные препараты, в которых часть водорослей потеряла подвижность, а другие продолжают медленно двигаться. Препараты следует изучать немедленно после фиксации, так как в течение короткого периода времени водоросли деформируются.

При изучении внутриклеточных структур, особенно у мелких жгутиковых, применяют окрашивание с помощью слабых растворов (0,005 – 0,0001%) нейтрального красного, метиленового голубого, нейтрального голубого, трипанового красного, бриллиант-крезилового синего, конго красного, зелени Януса, позволяющих более четко выявить клеточную оболочку, папиллы, слизь, вакуоли, митохондрии, аппарат Гольджи и другие органеллы.

Многие красители дают хороший результат лишь после применения специальных методов фиксации (при изучении фиксированных формальдегидом проб успешное применение красителей возможно только после тщательного отмывания исследуемого материала дистиллированной водой). Самый лучший фиксатор для цитологического исследования водорослей, в том числе изучения их ультраструктуры, – 1 – 2%-й раствор оксида осмия (раствор не подлежит длительному хранению). Водоросли, не имеющие настоящих клеточных оболочек, хорошо и быстро фиксируются метанолом. Раствор Люголя (1 г йодида калия и 1 г кристаллического йода в 100 мл воды) не только хорошо фиксирует водоросли, но и одновременно окрашивает крахмал в синий цвет.

Для изучения ядер успешно используют спиртово-уксусный фиксатор Кларка (три части 96%-го этилового спирта и одна часть ледяной уксусной кислоты) или жидкость Корнуа (шесть частей 96%-го этилового спирта, три части хлороформа и одна часть ледяной уксусной кислоты). Водоросли выдерживают в свежеприготовленном растворе фиксатора в течение 1 – 3 ч, затем промывают 96%-м этиловым спиртом (2 мин) и водой (10 мин). Следует подчеркнуть, что при цитологическом изучении водорослей в большинстве случаев в зависимости от специфики объектов экспериментальным путем подбирают наиболее эффективные фиксаторы, красители и время экспозиции. Применяются и другие методы окраски ядер.

Жгутики изучают в световом микроскопе с помощью окраски по Лефлеру. Для этого материал фиксируют оксидом осмия, на короткое время погружая в абсолютный спирт, и оставляют высохнуть. Затем добавляют несколько капель красителя (смесь 100 мл 20%-го водного раствора танина, 50 мл насыщенного водного раствора FeSO 4и 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина) и нагревают над пламенем горелки, не доводя до кипения, до появления пара. После ополаскивания дистиллированной водой препарат в течение 10 мин докрашивают карболфуксином (100 мл 5%-го водного раствора свежеперегнанного фенола и 10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина основного; смесь отстаивают в течение 48 ч, фильтруют и хранят в течение длительного времени), затем снова ополаскивают дистиллированной водой, дают высохнуть и заливают канадским бальзамом. Этим методом можно установить наличие или отсутствие на жгутиках волосков. Наблюдения за длиной жгутиков, характером их движения, местом прикрепления ведутся на живом материале методом фазового контраста.