Коллектив авторов - Инфекционные болезни у детей

Бактериальные инфекции характеризуются сочетанием лейкоцитоза и нейтрофилеза, часто со сдвигом формулы в сторону незрелых форм гранулоцитов – палочкоядерных, юных (тяжелые формы дифтерии, скарлатины, дизентерии и др.). Однако при некоторых бактериальных инфекциях отмечается лейкопения с лимфоцитозом (брюшной тиф, бруцеллез) или лейкоцитоз с лимфоцитозом (коклюш). СОЭ при большинстве бактериальных инфекций повышена, но может оставаться нормальной или сниженной (коклюш, бруцеллез). Изменения в гемограмме следует оценивать в зависимости от тяжести и периода болезни, с учетом развившихся осложнений.

Специфические методы лабораторной диагностики имеют особое значение для диагностики инфекционных заболеваний. Их подразделяют на несколько групп.

1. Выделение возбудителя – бактериологический и вирусологический методы.

2. Визуализация возбудителя – бактериоскопическое, вирусоскопическое, паразитологическое исследование.

3. Выявление антигенов возбудителя:

• РИФ – реакция иммунофлюоресценции;

• РНИФ – реакция непрямой иммунофлюоресценции;

• РИМ – радиоиммунологический метод;

• ИФА – иммуноферментный анализ;

• ПЦР – полимеразная цепная реакция;

• РА – реакция агглютинации;

• РЛА – реакция латекс-агглютинации;

• РПГА – реакция пассивной гемагглютинации;

• РНГА – реакция непрямой гемагглютинации;

• РСК – реакция связывания комплемента;

• РТГА – реакция торможения гемагглютинации;

4. Обнаружение специфических антител (серологическая диагностика): РА, РЛА, РПГА, РНГА, РСК, РТГА, ИФА, РИМ.

5. Кожные аллергические пробы.

6. Морфологические методы.

Методы выделения возбудителя. Материалом для исследований являются слизь из зева и носоглотки, кал, моча, мокрота, желчь, рвотные массы, а также кровь, цереброспинальная жидкость, содержимое пустул, язв, биопсийный, секционный материал и др.

Бактериологический метод является основным в диагностике кишечных инфекций, коклюша, дифтерии, стрептококковой и стафилококковой инфекций. Посев материала производят на элективные среды, учет колоний осуществляют после инкубации в термостате с экспозицией от нескольких часов до нескольких суток. В дальнейшем осуществляют биохимическое типирование возбудителя, фаготипирование и определение его чувствительности к антибиотикам.

Вирусологический метод используют для выделения возбудителя при вирусных инфекциях. Посевы материала от больного производят в первичные культуры клеток почек обезьян, клеток НеLa, культуры фибробластов, эмбриональные клетки человека. Вирусологический метод трудоемок, дорог, требует много времени и не получил широкого применения в практике.

Методы визуализации возбудителя.

Бактериоскопический метод – микроскопия окрашенных мазков исследуемого материала больного – имеет ограниченное применение и используется лишь при ряде инфекций (менингококковая, лептоспироз, возвратный тиф). Вирусоскопический метод – обнаружение вируса при электронной микроскопии исследуемого материала. В практике имеет ограниченное применение. Паразитологический метод является основным для диагностики паразитарных заболеваний (малярия, лямблиоз, амебиаз, криптоспоридиоз, пневмоцистоз, лейшманиоз). В основе метода – микроскопия специфически окрашенных и обогащенных мазков крови, экссудата, мокроты, кала, биоптатов органов.

Методы выявления антигенов возбудителя в сыворотке крови, секретах, выделениях или пораженных тканях используют для ранней экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.

Реакция иммунофлюоресценции и ее модификация — реакция непрямой иммунофлюоресценции , основаны на использовании явления люминесценции при соединении антигенов бактерий, вирусов, риккетсий со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (изотиоцианатом флюоресцеина). При прямом методе (РИФ) на взятый от больного материал, содержащий антиген (например, мазки-отпечатки со слизистой оболочки зева при ОРВИ или микоплазмозе верхних дыхательных путей), наносят специфическую люминесцирующую сыворотку, содержащую меченые антитела.

При непрямом методе (РНИФ) для выявления антигена мазок-отпечаток обрабатывают специфической немеченой сывороткой. Затем наносят люминесцирующую сыворотку к глобулинам немеченой сыворотки. Учет обеих реакций проводят под люминесцентным микроскопом. Метод прост, высокочувствителен и позволяет получить ответ через несколько часов от начала исследования. РИФ и РНИФ применяют для ранней экспресс-диагностики гриппа и других ОРВИ, коклюша, микоплазменной и хламидийной инфекций, дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллеза, чумы, туляремии, сифилиса, токсоплазмоза, бешенства, ВИЧ-инфекции.

Радиоиммунологический метод (РИМ), или радиоиммунный анализ (РИА), – высокочувствительный метод, основанный на применении радиоизотопной метки антигенов или антител (часто 125I). Обычно используют твердофазовый вариант РИМ, при котором антигены или антитела (в зависимости от задачи исследования) адсорбируются на твердом носителе (целлюлозе, полистироле). Сущность метода заключается в определении количества меченного радиоактивным йодом антигена после его контакта с гомологичными антителами сыворотки. Метод используют для диагностики вирусных гепатитов, бактериальных, риккетсиозных и протозойных заболеваний. Для выявления антигенов ВГВ к исследуемой сыворотке добавляют референс-сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В. Cмесь инкубируют 1 – 2 дня, затем добавляют к ней референс-антиген, меченный изотопом 125I, и продолжают инкубацию еще 24 ч. К образовавшемуся растворимому комплексу антиген – антитело добавляют преципитирующие антииммуноглобулины против белка референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата. Результат реакции учитывают по наличию и числу импульсов в преципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связывающегося со специфическими антителами референс-сыворотки, последние не вступают в связь с меченым антигеном, поэтому он не обнаруживается в преципитате.

Иммуноферментный анализ (ИФА) – высокочувствителен, легко воспроизводим и не требует радиоактивных реагентов, что делает его более доступным по сравнению с РИА. Принцип метода состоит в использовании антител, конъюгированных с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой), – конъюгатов. Присоединяясь к образовавшимся на твердой фазе иммунным комплексам, конъюгат способствует их выявлению в результате реакции фермента с хромогенным субстратом (ортофенилендиамином, тетраметилбензидином). В качестве твердой фазы используют различные материалы – панели для титрования, палочки и шарики, нитроцеллюлозные мембраны. Модификация с использованием мембран получила название ELISA ( enzime-linked immunosorbent assay ). Результаты анализа учитывают визуально и инструментально (с помощью ИФА-ридеров) по оптической плотности окрашенных продуктов реакции.