Алексей Сизенцов - Антибиотики и химиотерапевтические препараты

где Sp – расстояние, пройденное пятном изучаемого вещества;

Sf – расстояние фронта растворителя, пройденное от старта.

Воспроизводимость значении R fзависит от постоянства следующих факторов: качества бумаги, температуры, степени чистоты растворителей, состава газов атмосферы, в которую помещена бумага, однотипности процедур и аппаратуры.

При использовании метода хроматографии па бумаге для идентификации антибиотиков было показано, что значение R fзависит также и от системы растворителей, от степени очистки изучаемого антибиотика и от состава культуральной жидкости.

По спектру значении R fили, как его иногда называют, по хроматографическому спектру можно четко различать группы химически родственных антибиотиков и до некоторой степени отличать также антибиотики внутри групп.

Существенное значение при использовании бумажной хроматографии для идентификации антибиотиков имеет разработка методов, позволяющих проводить эти исследования на ранних этапах изучения антибиотических веществ, т.е. на стадии культуральных жидкостей. Однако при этом встречаются большие затруднения в разгонке антибиотиков, так как факторы, оказывающие влияние на значение R f, часто встречаются при использовании культуральных жидкостей.

Преодолеть эти затруднения удалось с помощью методов лиофилизации фильтратов культуральных жидкостей и экстрагирования их соответствующими растворителями . Сущность схемы хроматографической идентификации антибиотиков из культур на стадии малоактивных культуральных жидкостей состоит в следующем. Культуральную жидкость, обладающую антибиотическими свойствами, фильтруют и измеряют рН. Точно взятый объем фильтрата подвергают лиофильной сушке, затем лиофилизат взвешивают и разделяют на две части, одну из которых растворяют в воде, а другую экстрагируют безводным этанолом при встряхивании в течение часа. Растворители берут в таком количестве, которое, как правило, позволяет получить 5-10-кратные концентрации по сравнению с исходной культуральной жидкостью. Антибиотическую активность водного раствора и спиртового экстракта определяют методом бумажных дисков.

В случае если спиртовой экстракт обладает антибиотической активностью, схожей с активностью водного раствора лиофилизата, то проводят хроматографирование в соответствующей системе. Хроматограммы проявляют биоавтографически на чашках с Bacillus subtilis . Одновременно производят электрофорез в ацетатном и фосфатном буферах.

Если для изучаемого антибиотика во всех системах 1-го типа значение R fбудет около 0,8 и выше, то спиртовой экстракт хроматографируют в другой системе. При помощи набора этой системы можно наиболее уверенно отличить антибиотики типа эритромицина и олеандомицина, типа карбомицина, типа актиномицина и хлорамфеникола.

Полученные данные позволяют в определенной степени идентифицировать антибиотик или включить его в определенную группу химически близких веществ, или, наконец, определить его как новый антибиотик.

Пути выделения продуцентов антибиотических веществ из естественных мест их обитания и их первичной идентификации представлено на схеме (рисунок 2).

Рисунок 2 – Схема выделения актиномицетов – продуцентов антибиотиков (по Коневу, 1981)

Если в результате проведенной работы по идентификации выделенного микроорганизма установлено, что он является новым видом, и антибиотическое вещество, образуемое им, не принадлежит к уже описанным соединениям, то и организм и антибиотик должны быть подвергнуты детальному исследованию. С этой целью, прежде всего, изучаются условия культивирования микроба, обеспечивающие максимальное образование антибиотика.

При подборе сред необходимо иметь в виду, что чем сложнее среда, тем труднее производить выделение и очистку антибиотика, поэтому среда для культивирования должна быть по возможности простой по составу и обеспечивать максимальное образование антибиотического вещества.

Выделение антибиотиков и их очистка осуществляются разными способами, выбор которых зависит от химической природы антибиотика, характера сопутствующих антибиотику продуктов жизнедеятельности организма (органические кислоты, аминокислоты, пигменты и другие соединения), неиспользованных компонентов среды (углеводы, масла, азотсодержащие вещества, неорганические соли и др.), а также от того, где накапливается это вещество – в культуральной жидкости или в клетках продуцента. Основная задача первых этапов выделения антибиотического вещества – концентрирование биологически активного соединения и очистка от сопутствующих балластных веществ.

Основными методами выделения антибиотиков из нативных растворов (культуральная жидкость, освобожденная от биологической массы продуцента) можно назвать следующие: осаждение антибиотика, методы экстракции антибиотиков органическими растворителями, сорбционные методы с использованием поверхностно-активных веществ (активированный уголь, активированный оксид алюминия и др.) или ионообменных материалов (ионообменные смолы). При применении сорбционных методов выделения антибиотиков наиболее трудной задачей является десорбция (элюирование) препарата.

Антибиотик, выделенный одним из указанных способов, представляет собой лишь технически чистый препарат, который не может еще использоваться в медицинской практике. Дальнейшая очистка препарата осуществляется или путем повторной сорбции, перекристаллизации, растворением антибиотика в органических растворителях, или иными методами.

После того как антибиотическое вещество с помощью того или иного метода выделено и хорошо очищено, проверяют его биологическую активность по отношению к широкому ряду микроорганизмов (проверяют широкий антимикробный спектр). Кроме того, антибиотик исследуют на стерильность, токсичность, пирогенность, испытывают в отношении действия на лейкоциты крови и определяют другие показатели.

Выяснение стерильности готового препарата необходимо для установление отсутствия в нем спор микроорганизмов, прежде всего патогенных. Для этого необходимо, если это возможно, инактивировать антибиотические вещества, а затем произвести посев его на разнообразные по составу питательные среды (мясопептонный бульон, печеночный бульон, кровяной агар и т.п.).