Алексей Сизенцов - Антибиотики и химиотерапевтические препараты

7 Контроль производства. Указываются особые требования к оборудованию (герметичность ферментера и всех коммуникаций, исправность и надежность работы мешалки и т.д.), анализ качества сырья, соответствующего определенным стандартам, режимы стерилизации сред и отдельных веществ, воздуха, методы анализа процесса биосинтеза антибиотика и готовой продукции.

8 Техника безопасности, пожарная безопасность и производственная санитария. Приводится перечень веществ, способных воспламеняться и взрываться. Все вещества, применяемые в процессе получения антибиотика, должны быть изучены с позиций техники безопасности, пожарной безопасности и производственной санитарии.

9 Перечень производственных инструкций. Приводятся все инструкции, которые должны быть разработаны на основе лабораторного регламента.

10 Технико-экономические нормативы. Указываются выходы конечного продукта и промежуточных продуктов; удельные нормы расхода сырья и материалов, удельные нормы расхода технологических энергозатрат (пара, воды, электроэнергии, сжатого воздуха).

11 «Информационные материалы». В разделе указываются биологические и физико-химические свойства вещества, степень их очистки, фармакологические свойства (преимущества и особенности), сравнение с показателями идентичных зарубежных препаратов, сведения о патентной чистоте антибиотика и методе его получения с перечислением охраняющих авторских свидетельств (патентов), сведения о вредности веществ, применяемых при получении препарата, и мерах предосторожности при работе с ними.

Микроорганизмы-продуценты антибиотиков, выделенные из природных субстратов, обычно обладают низкой антибиотической активностью. Так, например, различные штаммы Penicillium, выделенные из почв, образуют пенициллин при глубинном их выращивании в количестве от 10 Ед/мл до 30 Ед/мл культуральной жидкости. Продуцент стрептомицина Str.griseus , впервые выделенный Ваксманом с сотрудниками в 1944 г. из сильно унавоженной почвы, образовывал до 100 мкг/мл стрептомицина.

Понятно, что потребности медицины, сельского хозяйства и некоторых отраслей промышленности не могут быть удовлетворены без получения наиболее продуктивных штаммов организмов, образующих антибиотические вещества.

Поэтому перед наукой поставлена задача разработки путей повышения биосинтеза практически ценных антибиотических веществ. При решении этой задачи необходимо применять два тесно связанных метода: селекцию наиболее активных форм продуцентов антибиотиков и изучение условий культивирования полученных вариантов с целью определения наиболее оптимальной биосинтетической активности.

В селекционной работе по получению активных продуцентов антибиотических веществ используют различные приемы, в основе которых лежат методы и законы генетики.

Прежде всего, при изучении вновь выделенных микроорганизмовпродуцентов антибиотиков стремятся отобрать наиболее активные варианты, имеющиеся в культуре.

Микроорганизмы обладают естественной изменчивостью, т.е. среди клеток или спор одного и того же штамма могут обнаружиться формы, отличающиеся по морфологическим или биохимическим, в том числе и по антибиотическим признакам. Остановимся на разборе метода отбора наиболее активных антибиотикообразующих вариантов микроба.

Продуцент антибиотика высевают на пластинку питательного агара в чашке Петри с таким расчетом, чтобы получить на ней развитие не более 40-50 изолированных колоний. После достаточно хорошего развития колоний проверяют их способность к образованию антибиотика (в основном двумя методами).

Первый метод . Выросшие колонии заливают расплавленным и охлажденным до 55 °C питательным агаром, содержащим тест-организм, чувствительный к изучаемому антибиотику. Затем чашки помещают на 20-24 ч в термостат при температуре, оптимальной для развития тест-культуры. За это время вокруг колоний образуются зоны отсутствия роста тест-организма. Размеры диаметра зон отсутствия роста вокруг колоний микроорганизма бывают различными. Чем больше колония образует антибиотика, тем большей будет зона отсутствия роста тест-организма. Такие наиболее активные колонии легко обнаружить (рисунок 3).

1 – питательный агар с тест-организмом; 2 – питательный агар для развития колоний продуцента антибиотика; 3 – колония; 4 – зона диффузии антибиотика.

Рисунок 3 – Схема опыта по определению антибиотической активности колоний микроорганизмов методом заливки их питательным агаром, содержащим тест организмы

Для выявления изменчивости, связанный с образованием антибиотиков у бактериальных организмов (споровых), на колонии перед заливкой расплавленного агара можно помещать стерильные диски фильтровальной бумаги, диаметр которых равен внутреннему диаметру чашки Петри. Таким диском фильтровальной бумаги прикрываются выросшие колонии бактерий, а расплавленный агар наливается на поверхность бумажного диска. Это облегчает последующее выделение наиболее активной колонии в чистом виде.

При селекции наиболее активных штаммов продуцентов ряда антибиотиков, выделенных из естественных мест их обитания, используют антибиотики. Например, для выделения из почвы наиболее активных штаммов продуцента стрептомицина в агаровую среду, используемую для их высева, добавляют определенную концентрацию стрептомицина. Штаммы Str.griseus , образующие большие количества антибиотика, способны выдерживать такую концентрацию стрептомицина и нормально развиваться в его присутствии. Менее активные штаммы не приспособлены к высоким концентрациям стрептомицина и в его присутствии не развиваются.

В питательную агаровую среду вносят стрептомицин в количестве 100 мкг/мл субстрата, а затем высевают выделенные штаммы актиномицетов, относящиеся к Sir.griseus . В результате культуры, чувствительные к этой концентрации стрептомицина, не давали развития примерно в 80 % случаев. Остальные 20 % штаммов, среди которых были и довольно активные, вырастали на этой среде. Приведенный метод оказывается полезным при первичном исследования почвенных культур актиномицетов.

Однако методы выделения наиболее активных форм, получающихся в результате естественной изменчивости, не дают значительного повышения образования антибиотиков.

Решающим приемом, обеспечивающим успех селекции многих продуцентов антибиотиков, является метод получения мутаций под влиянием сильнодействующих факторов – рентгеновских и ультрафиолетовых излучений, некоторых химических соединений (азотистой формы иприта др.). При действии таких факторов в течение определенного периода времени происходит полная гибель микроорганизмов. Однако можно подобрать экспозицию (концентрацию) и силу воздействия, при которых часть клеток или спор изучаемого вида может выжить.