Сэмюел Стернберг - Трещина в мироздании [litres]

На встречах с Джилл и несколькими заинтересованными учеными в Национальной лаборатории имени Лоуренса всего в нескольких минутах ходьбы от моего кабинета в Беркли мы с Блейком размышляли, как нам организовать наши эксперименты. Главный вопрос заключался в том, какой модельный организм нам использовать. В качестве одного из вариантов мы рассматривали Sulfolobus solfataricus , архею, которую впервые выделили из воды горячих источников вулкана Сольфатара рядом с Неаполем. Известно было, что ее клетки содержат CRISPR и что их поражают вирусы, обнаруженные Блейком в Йеллоустоне и на Камчатке, – что было удобно, поскольку Блейк был хорошо знаком с этими формами.

Другим “кандидатом” выступала кишечная палочка Escherichia coli , которую часто называют просто E. coli . Наиболее хорошо изученный на данный момент вид бактерий, E. coli подвержена заражению десятками одинаково хорошо изученных фагов, многие из которых можно просто заказать в интернете. (Также E. coli принадлежит честь быть первой бактерией, у которой определили последовательность CRISPR [59] Y. Ishino et al., “Nucleotide Sequence of the Iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli , and Identification of the Gene Product”, Journal of Bacteriology 169 (1987): 5429–5433. .) В дополнение к этому Блейк предложил Pseudomonas aeruginosa , патогенную бактерию, которая, как было известно, устойчива ко многим антибиотикам и несет в себе CRISPR. Мы знали, что сможем манипулировать ДНК P. aeruginosa , используя разнообразные инструменты генной инженерии, и что эту бактерию инфицируют многочисленные фаги (Блейк провел некоторое время в поисках новых фагов Pseudomonas , но не в экзотических местах вроде Йеллоустона, а на местных канализационных очистных сооружениях области залива Сан-Франциско).

Блейк четко дал мне понять, что он хочет сфокусироваться на изучении биохимии и структурной биологии во время работы в моей лаборатории, и ему не терпелось приступить к научной работе в новом направлении. Перед исследованиями CRISPR он очистил белки семейства Cas, закодированные в геноме P. aeruginosa , и стал проверять их на способность каким-либо образом распознавать или разрушать вирусную ДНК, начав с наиболее распространенного из них – белка Cas1. Затем (это было в 2007 году, примерно в то же время, когда Блейк начал работать в моей лаборатории) Джилл сообщила нам, что скоро будет опубликована важная статья исследователей из Danisco – датской биотехнологической компании и одновременно одного из ведущих мировых производителей пищевых ингредиентов. В своем исследовании они с помощью генетических методов показали, что CRISPR действительно представляет собой бактериальную иммунную систему [60] R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes”, Science 315 (2007): 1709–1712. – хотя спектр ее возможностей на тот момент оставался неизвестным.

Предметом исследования ученых из Danisco была ферментирующая молоко бактерия под названием Streptococcus thermophilus , один из ключевых пробиотиков, используемых в производстве йогурта, сыра моцарелла и бесчисленного множества других молочных продуктов. Человечество поглощает существенно больше миллиарда триллионов клеток живых S. thermophilus в год, и годовая рыночная стоимость культур этих бактерий превышает сорок миллиардов долларов [61] A. Bolotin et al., “Complete Sequence and Comparative Genome Analysis of the Dairy Bacterium Streptococcus thermophilus ”, Nature Biotechnology 22 (2004): 1554–1558. . Вероятно, не стоит удивляться, что эти масштабные инвестиции в молочную промышленность постоянно находятся под угрозой фаговых инфекций – наиболее распространенной причины потерь продукции и неполного брожения. В одной капле сырого молока содержится от десятка до тысячи вирусных частиц, что делает полное уничтожение фагов в нем просто невозможным. Компании, подобные Danisco , пытались бороться с фагами, совершенствуя технологии очистки молока и оборудование фабрик, а также принимая другие меры, – но проблему так и удалось решить [62] M. B. MarcÓ, S. Moineau, and A. Quiberoni, “Bacteriophages and Dairy Fermentations”, Bacteriophage 2 (2012): 149–158. .

Работая совместно с Филиппом Хорватом и его командой из французского филиала Danisco , группа исследователей под руководством Родольфа Баррангу из американского филиала компании изучала S. thermophilus в попытках найти решение. Родольф и Филипп задумались над тем, что делает некоторые штаммы S. thermophilus более устойчивыми к фаговым инфекциям по сравнению с другими. В молочной промышленности уже начали применять линии мутантных бактерий, менее восприимчивых к бактериофагам, но Родольф и Филипп подозревали, что участки CRISPR в геноме S. thermophilus могут обеспечивать бактерии иммунитетом такого типа, что он окажется даже более сильным, чем случайные мутации у упомянутых штаммов.

Последовательности CRISPR у S. thermophilus , как было известно Родольфу и Филиппу, обладают определенными необычными свойствами, которые можно было бы использовать в экспериментальной работе. Александру Болотину удалось обнаружить некоторые из этих свойств, когда он секвенировал геном S. thermophilus ; позднее Болотин сосредоточился на изучении ДНК CRISPR и в конце концов проанализировал более двадцати различных штаммов. В ходе этой работы он заметил, что, хотя повторяющиеся последовательности CRISPR (заштрихованные черным ромбики на рисунке Джилл) всегда были одинаковыми, спейсерные последовательности (пронумерованные квадратики на том же рисунке) у представителей разных штаммов заметно отличались. Более того, многие из этих спейсеров фактически совпадали с участками фаговых геномов, секвенированными незадолго до этого. (Результаты работы Болотина обобщены в одной из трех статей 2005 года, которые Джилл показывала мне в кафе Free Speech Movement .) Главный вывод из статьи Болотина таков: штаммы S. thermophilus , в CRISPR которых было больше таких спейсеров, оказались более устойчивыми к заражению фагами. Хотя было не особенно понятно, какое это имеет значение, казалось, что бактерии неким образом модифицируют свою ДНК в составе CRISPR, имитируя геномы определенных фагов и совершенствуя собственную иммунную систему – если предположить, что CRISPR является таковой, – чтобы эффективнее бороться с этими вирусами.

Основываясь на работе Болотина, Родольф и Филипп спланировали эксперименты для проверки этого предположения. Действительно ли штамм S. thermophilus способен повышать свою устойчивость к конкретному бактериофагу, вставляя себе в область CRISPR новые фрагменты ДНК, совпадающие с последовательностями ДНК этого фага?

В своих опытах исследователи из Danisco сосредоточились на штамме S. thermophilus , который широко используется в молочной промышленности, и на двух вирулентных фагах, выделенных из образцов фабричного йогурта. Основой методики послужили простейшие генетические эксперименты – подобные проводили с начала XX столетия. Ученые заражали популяции бактерий в отдельных пробирках двумя фагами, инкубировали их 24 часа, а затем проверяли, остались ли в этих культурах живые бактерии, высевая их в чашки Петри и оставляя их на ночь расти. Было обнаружено, что, хотя фаги уничтожили более 99,9 % бактерий, девять новых, мутировавших штаммов S. thermophilus , видимо, были устойчивы к заражению фагами.