Крейг Вентер - Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии

Другое дело, что для применения этих методов к M. genitalium были серьезные практические препятствия. Нокаутировать гены у организма вроде дрожжей относительно легко благодаря арсеналу генетических инструментов, применимых к таким видам. Для микоплазм таких инструментов просто нет – как нет и инструмента для многих последовательных изменений генов.

Один из фундаментальных инструментов молекулярной биологии – отбор с помощью антибиотиков. При таком отборе клетки, в которых были изменены гены, отбираются путем убивания всех немодифицированных клеток антибиотиком. Модифицированные клетки выживают, потому что плазмиды ДНК, применяемые для введения в них новых генов, содержат еще и гены устойчивости к антибиотику. Хотя эта технология – основа большинства молекулярно-биологических экспериментов, к сожалению, в них применяется лишь несколько систем для отбора антибиотиками, что сильно ограничивает число последовательных изменений генов, которые можно проделать.

Для решения одной из проблем Клайд Хатчинсон предложил уникальный подход, который мы назвали «полногеномным транспозонным мутагенезом», при котором небольшая молекула ДНК, называемая транспозоном, разрывает ген, что позволяет нам судить, насколько этот ген был важен. Транспозоны, или мобильные генетические элементы, – это относительно короткие последовательности ДНК, способные встраиваться в геном – в определенные участки или в случайные места. Американка Барбара Макклинток открыла транспозоны в кукурузе, где они меняли распределение пигментации зерен. Эта работа принесла ей в 1983 году Нобелевскую премию {101} 101 http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1983/press.html . Транспозоны можно считать эгоистичными генами, вроде вирусов, которые «заражают» геном. Оказывается, изрядная доля вашего генома состоит из таких ДНК-паразитов. Они важны, и не в последнюю очередь потому, что могут вызывать генетические болезни, если вставятся в ключевой ген и нарушат его функционирование.

Мы выбрали транспозон (Tn4001) , выделенный у Staphylococcus aureus , чтобы он случайно вставлялся в геном M. genitalium и нарушал функционирование генов. Мы растили клетки, которые пережили такие вставки, выделяли и секвенировали их ДНК, начиная с праймера последовательности, который связывается только с транспозоном, чтобы точно определить, где в геноме окажется транспозон. Если Tn4001 вставится в середину гена и клетки это переживут, то мы считали этот ген несущественным для жизни.

После транспозонной бомбардировки генома мы сочли жизненно важными все гены, которые в живых клетках не имели транспозоновых вставок. Но проанализировав свои данные, мы поняли, что эта абсолютная система счета наивна, что гены и геномы существуют в определенных условиях и что жизнь не определяется одними генами. Поскольку все клетки получают ключевые питательные вещества и химикаты из окружающей среды, то, когда эта среда изменяется, ключевыми для жизни оказываются другие гены.

Белки мембранного транспорта ответственны за перенос важных питательных веществ из окружающей среды в клетки. Например, M. genitalium может расти как на глюкозе, так и на фруктозе, и у нее есть два гена, в которых зашифрованы специфические белки-транспортеры для каждого из этих сахаров. В наших исследованиях с транспозоновыми вставками оба гена оказались в группе несущественных для жизни, что поначалу нас удивило: ведь они были ключевыми для способа питания этого организма. Однако мы поняли, что среда, на которой мы обычно растили клетки M. genitalium , содержит и глюкозу, и фруктозу, что означает, что если ген какого-то транспортера выключается, то клетка просто переключается на потребление другого сахара. Напротив, если мы растили клетки только на одном сахаре, то, при вырубании транспортера именно этого сахара клетки умирали. Для некоторых функций, таких как метаболизм сахаров, определить «условно жизненно важные гены» нетрудно, но для тех генов, функции которых в клетке еще неизвестны, нет очевидного способа убедиться, не замещен ли разорванный ген другим.

Это оказалось особенно важно, когда мы включили в исследования вид Mycoplasma pneumonia , ближайшего известного родича M. genitalium , размер генома которого – 816 000 пар оснований, т. е. на 236 000 пар больше, чем у M. genitalium . Опять же мы хотели соединить работы по транспозоновой вставке со сравнительной геномикой, чтобы определить минимальный набор генов, нужных для жизни. Практически у каждого из 480 белок-кодирующих генов Mycoplasma genitalium в геноме M. pneumonia есть «родич», происходящий от общего с ним предкового гена (ортолога), и кроме того, есть еще 197 генов. Это наводит на соблазнительную мысль: не может ли набор из 480 генов, общих для двух видов, уже быть близок к минимальному геному? Наше исходное предположение состояло в том, что все 197 «лишних» генов в геноме M. pneumonia можно уничтожать вставками транспозонов, поскольку само существование M. genitalium предполагает, что они не необходимы для жизни. Результаты были не слишком удовлетворительны и информативны: мы обнаружили, что всего вставками транспозонов были разрушены 179 генов M. pneumonia , но из 197 «лишних» были разрушены лишь 140.

Сопоставив наши работы, мы вычислили, что у M. genitalium от 180 до 215 несущественных генов и от 265 до 350 – существенных. Из последних функция 111 неизвестна. Это явно не было точным определением жизни, которое мы искали. К тому же по мере проработки этих данных становилось всё очевиднее, что есть гены, каждый из которых сам по себе несущественен, но все вместе их удалять нельзя.

Учитывая скудость молекулярно-биологических инструментов и ограниченность данных по транспозонам, мы решили, что единственный путь получения минимального генома – попытаться синтезировать целый бактериальный геном с нуля. Нам надо будет химически синтезировать целую хромосому, используя только существенные гены. Однако это была бы громадная задача. Хотя ученые и писали маленькие кусочки генетических текстов уже почти полстолетия, никто не сделал ни одной конструкции из ДНК размером хотя бы в сотую долю того, что был нужен нам.

Работа над химическим синтезом ДНК начиналась в 1950-е, с успеха Хара Гобинда Кораны и Маршалла Ниренберга, но заметный прогресс был сделан лишь в 1980-е вслед за внедрением автоматического синтезатора ДНК Марвином Карузерсом из Колорадского университета в Боулдере. В его синтезаторе стояли четыре бутыли с нуклеотидами А, Т, Ц и Г, из которых они добавлялись по одному в предписанном порядке. Таким образом ДНК-синтезаторы могут делать короткие цепочки ДНК, называемые олигонуклеотидами. Однако при увеличении длины олигонуклеотидов выход продукта и точность падают. Вокруг синтеза олигонуклеотидов и продажи их исследователям выстроилась целая индустрия, потому что синтетическая ДНК применяется в молекулярной биологии для секвенирования ДНК и проведения ПЦР (полимеразных цепных реакций).