Крейг Вентер - Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии

После завершения секвенирования человеческого генома в компании Celera я вновь обратился к проблеме генетического «прожиточного минимума» и дальнейшей работе над синтетическими геномами. Хэм Смит оставил Celera , чтобы примкнуть ко мне. Для финансирования этих работ мы вдвоем подали заявку на большой грант в министерство энергетики США (МЭ). Оно ведет крупную программу «Геномы для жизни», выросшую из их работ по человеческому геному. Еще раньше МЭ финансировало полное секвенирование моей командой некоторых первых геномов, в том числе M. genitalium и Methanococcus jannaschii . В итоге МЭ предоставило нам пятилетний грант с ежегодным бюджетом в 5 миллионов долларов – хорошее начало, сделавшее для нас возможной разработку двух новых областей, у которых, как мы считали, были потрясающие перспективы.

Первая радикально расширяла мою раннюю работу по секвенированию геномов, которая потом стала называться метагеномикой. Вместо сосредоточения на конкретных видах мы стали искать, как получить генетический «моментальный снимок» всего микробиологического разнообразия в такой среде, как океан или человеческий кишечник. Многие мои коллеги сомневались, что секвенирование дроблением всех организмов в образце морской воды сработает, потому что мы имеем дело с супом из множества разных видов. Скептицизм навевало то, что необходимо было одновременно секвенировать тысячи геномов, присутствующих в образце, а затем с помощью компьютера «перекоммутировать» фрагменты, стыкуя один с другим только те, что относятся к одному геному (как мы делали это с человеческим геномом). Но я был уверен, что нуклеотидная последовательность достаточно уникальна для каждого вида, чтобы можно было восстановить ее в компьютере из сложной смеси фрагментов разнородных последовательностей.

Как оказалось, мой новый метод секвенирования «дроблением среды» был весьма успешным. Мы начали с образцов воды из Саргассова моря вокруг Бермудских островов, которое в то время многими считалось «океанской пустыней» из-за нехватки доступных питательных веществ. В этом «пустом» море мы только в одном образце нашли более 1,2 млн ранее неизвестных генов и как минимум 1800 видов {113} 113 Venter, J. Craig, Karin Remington, John F. Heidelberg, Aaron L. Halpern, Doug Rusch, Jonathan A. Eisen, Dongying Wu, Ian Paulsen, Karen E. Nelson, William Nelson, Derrick E. Fouts, Samuel Levy, Anthony H. Knap, Michael W. Lomas, Ken Nealson, Owen White, Jeremy Peterson, Jeff Hoffman, Rachel Parsons, Holly Baden-Tillson, Cynthia Pfannkoch, Yu-Hui Rogers, and Hamilton O. Smith. “Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea.” Science, 2 апреля 2004, 304 (5667), стр. 66–74. . Бедная питательными веществами морская вода была полна жизни, потому что энергию организмы получали напрямую из солнечного света. Мы обнаружили, что фотосинтезировали не только растения: почти каждый микроорганизм в верхних слоях океана имеет светочувствительный белок – фоторецептор родопсин, очень похожий на тот, что работает в наших глазах. За последние шесть лет нашей работы в составе экспедиции Sorcerer II , отбиравшей образцы через каждые двести миль и покрывшей за эти годы больше шестидесяти тысяч миль по морю, мы обнаружили более восьмидесяти миллионов генов. То, что раньше считалось одним видом, теперь оказалось совокупностью тысяч близкородственных организмов. На основании множества работ мы прикинули, что в океане примерно 10 30одноклеточных организмов и 10 31вирусов. Это значит, что на каждого человека на планете приходится по миллиарду триллионов организмов.

Второе направление исследований, профинансированное МЭ, позволило нам начать с начала путь к тому, чтобы впервые создать синтетическую жизнь. Клайд Хатчинсон на основании своей ранней работы с Робертом Синшаймером и Фредом Сэнгером предложил в качестве тестового проекта бактериофаг phi X 174 . Это был заманчивый объект по целому ряду причин. Геном бактериофага маленький, phi X 174 не выдержит много генетических изменений, так что это сразу будет проверкой на точность синтеза. И к тому же об этом вирусе очень много информации – благодаря усилиям Корнберга, Сэнгера и, конечно, Синшаймера, вдохновленного на изучение фагов Максом Дельбрюком и выбравшего, понятное дело, один из самых маленьких, какой сумел найти {114} 114 http://oralhistories.library.caltech.edu/33/0/OH_Sinsheimer.pdf .

Чтобы проверить простую методику синтеза, мы в 1997 году предприняли первую попытку синтезировать геном phi X 174 из набора перекрывающихся олигонуклеотидов в 50 пар оснований каждый, с последующей полимеразной цепной реакцией, чтобы сделать копии генома. Сначала нам показалось, что эксперимент удался. В записях лаборатории Клайда Хатчинсона значится, что 22 апреля мы получили молекулы ДНК, размер которых соответствовал целому геному phi X 174 . Ключевой вопрос: был ли синтез достаточно точным, чтобы получить вирус? Мы собирались попытаться заразить синтетической ДНК клетки E. coli . Если ДНК не содержит летальных ошибок, то бактерия начнет производить специфические вирусные белки, которые будут самособираться в новые копии вируса phi X . Увы, наш синтетический геном не оказал вообще никакого действия. Мы знали, что синтез ДНК подвержен ошибкам, но надеялись, что путем отбора в ходе заражения на миллион цепочек ДНК найдется хотя бы одна с правильной последовательностью. Эта надежда разбилась, когда до нас дошел смысл этой неудачи. Точный синтез ДНК даже маленького вируса оказался задачей, требующей куда больше труда и умения, чем мы себе представляли. Что же говорить о более масштабной затее – создать полный бактериальный геном для получения живой клетки! Мы всей командой разрабатывали стратегию, как нам продвигаться дальше, и взвешивали, достижима ли вообще наша цель – синтетическая жизнь. Однако эти критические обсуждения были на несколько лет отодвинуты возможностью секвенировать человеческий геном. А уж когда мы на гребне нашего успеха с секвенированием человеческого генома вернулись к проблеме синтетического генома, мы уже были обречены на удачу.

Наши ранние попытки за несколько лет до того синтезировать phi X 174 провалились, очевидно, из-за ошибок, которые неизбежны при синтезе олигонуклеотидов. Если бы автоматические синтезаторы ДНК были способны производить чистые, свободные от ошибок, олигомеры заданной последовательности, сборка длинных двухцепочечных молекул ДНК была бы относительно простым делом. Но в реальности лишь около половины синтезированных молекул имеют правильную длину цепочки; остальные молекулы по большей части усеченные. Обычной причиной того, что они короче, чем ожидалось, становилось то, что в синтезаторе попадалось основание, которое не встраивалось; это назвали проблемой N-1. Эти неправильные молекулы или останавливали сборку олигонуклеотидов, или на выходе получалась ДНК с ошибками.