Крейг Вентер - Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии

Мы проделали простые вычисления, чтобы иметь представление, почему опыт не удался. Поскольку в среднем только одна из двух молекул, использованных для сборки ДНК фага, была правильной, то стало совершенно – и безнадежно – ясно, почему наша давняя сборка не удалась. При случайном выборе 130 неочищенных олигонуклеотидов вероятность того, что цепочка генома нашего phi X собралась бы правильно, была одна вторая в 130 степени: (1/2) 130, или 10 –39, – исчезающе малая величина. Мы посчитали, что еще до отбора на заразность нужно снизить долю неправильных олигонуклеотидов до менее чем 10 % от всей популяции – только тогда мы могли рассчитывать на шанс создать достаточно много правильных молекул.

Мы начали все сначала. Первым делом мы заново оценили геном, который хотели сконструировать, чтобы абсолютно убедиться, что мы начинаем с точной вирусной последовательности. Мы брали за основу этой последовательности ту, что была в исторической статье 1978 года Фреда Сэнгера и его коллег. Нам повезло, что Клайд Хатчинсон сохранил образец того вируса, который исходно секвенировали, поэтому мы могли пересеквенировать его новейшими методами, чтобы проверить точность работы команды Сэнгера. Мы нашли только три отличия на 5384 пары оснований, и было неизвестно, то ли это ошибки в исходном секвенировании, то ли изменения, произошедшие при новом выращивании образца вируса. В любом случае сиквенс Сэнгера оказался очень точным, что подтвердило успех его команды.

Точность секвенирования всегда была проблемой для геномики. Точность изрядной части ранних сиквенсов ДНК была намного ниже 99 % (одна ошибка на 100 оснований). Лишь немногие лаборатории придерживались «высокого» стандарта, установленного для человеческого генома, – одна ошибка на десять тысяч оснований. Между тем для написания генетического текста нужна точность на порядки выше, чем текущие стандарты для чтения ДНК. Поскольку оцифрованные последовательности ДНК должны стать основой для конструирования и синтеза генома, сиквенс, на котором она основана, должен быть чрезвычайно точным, чтобы организм с таким геномом мог жить. (Позже мы установили, что одна «опечатка» – выпадение всего одного основания – из 1,1 миллиона букв генетического текста может быть вопросом жизни и смерти, когда речь идет о создании первой синтетической клетки.)

Со времен работы Синшаймера мы знали, что геном phi X 174 , чтобы стать заразным, должен быть кольцевым {115} 115 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002228366280031X . Чтобы синтезировать работающий кольцевой геном, мы разбили проблему на несколько этапов. Внеся в компьютер последовательность ДНК фага, мы затем разделили геном на перекрывающиеся куски, которые были достаточно малы, чтобы их мог сделать синтезатор ДНК. Чтобы синтезировать фага, мы сделали 259 олигомеров, каждый 42 основания в длину. Перекрываясь, они покрывали весь геном. Смысловая [12] Смысловой называется та из двух цепочек в молекуле ДНК, с которой считывается РНК. Вторая ( антисмысловая ) цепочка комплементарна смысловой и служит матрицей для синтеза смысловой цепочки при удвоении ДНК. цепочка должна была сформироваться из 130 этих олигомеров, а другие 129 должны были образовать антисмысловую цепочку. Поскольку геном phi X 174 состоит из 5384 пар оснований, в конструкции предусматривались области перекрывания между кусками из 42 оснований (мы их назвали «сорокдвамеры» – от греческого meros , т. е. часть, в данном случае нуклеотид), а также дополнительные последовательности, которые мы добавили к каждому концу генома, чтобы сдублировать место рестрикции (в геноме оно содержится только один раз – там, где фермент рестриктаза PstI может резать ДНК), чтобы создать перекрывающиеся концы, которые свяжутся друг с другом, заставив ДНК закольцеваться.

Зная, что лишь половина синтезированных «сорокдвамеров» будет правильной длины, мы рассудили, что сильно улучшим точность сборки, предварительно очистив олигонуклеотиды. Гели для секвенирования ДНК разделяют молекулы ДНК разной длины и способны различать молекулы с разницей всего в один нуклеотид. В процессе, который называется гель-электрофорез, отрицательно заряженные молекулы нуклеиновой кислоты двигаются сквозь агарозный гель под действием электрического поля. «Усеченные» олигомеры меньше и в силу этого двигаются быстрее, чем олигомеры правильного размера. Просто разрезав гель бритвенным лезвием, мы могли отделить полосу с молекулами нормальной длины, чтобы использовать их для сборки смысловой и антисмысловой цепочек phi X 174 .

Теперь у нас были компоненты для сборки генома фага – очищенные олигомерные цепочки. После этого мы объединили смысловые и антисмысловые олигомеры, которые, благодаря перекрывающейся схеме, сами выстроились в правильном порядке, подобно самособирающимся блокам лего. Тогда мы связали их насовсем с помощью фермента ДНК-лигазы. Вместо того фермента, что был у Корнберга, мы выбрали более мощную лигазу из высокотемпературного организма, которая долго сохраняла активность. Оставив пул олигомеров на восемнадцать часов реагировать при температуре в 55 градусов, мы получили из олигомеров по 42 основания более крупные фрагменты: в среднем по 700 оснований, а некоторые – по две-три тысячи.

Из этих более длинных кусков ДНК мы смонтировали полноразмерную геномную последовательность phi X 174 методом полимеразной цикличной сборки (ПЦС). Это вариант полимеразной цепной реакции (ПЦР) – обычного метода размножения ДНК. С помощью ПЦР мы можем приумножить небольшие количества ДНК. При нагреве ДНК денатурируется или «тает»: двойная спираль разделяется на две одноцепочечные молекулы. Дальше термоустойчивая Taq -полимераза, используя эти цепочки как матрицы, делает две новых цепочки ДНК. Это удваивает исходную ДНК, так как каждая из новых молекул содержит одну старую и одну новую цепочки. Затем каждая из этих цепочек может быть использована для создания новых копий и так далее.

В варианте процесса ПЦС мы начали со всех более крупных кусков ДНК с первого этапа сборки (в которых было в среднем по 700 пар оснований). Мы снова расплавили двухцепочечную ДНК до одиночных цепочек. Вместо копирования одинарных цепочек ДНК-полимеразой мы позволили реакционной смеси остыть, чтобы одинарные цепочки слиплись с любыми комплементарными участками. Поскольку последовательности наших фрагментов частично перекрывались на концах, в такой смеси часть цепочек объединялась не со своей парой, а с парой «соседнего» фрагмента, сцепляясь с ним лишь концами – как если совместить только первые фаланги ваших указательных пальцев. Большая часть таких цепочек оставалась одинарной, и ДНК-полимеразы, используя их как матрицу, достраивали к ним комплементарные цепочки. В результате из двух фрагментов получался один, почти вдвое большей длины. Повторяя этот цикл, можно построить кусок ДНК длиной в несколько тысяч пар оснований, причем сделать это относительно быстро. Циклы продолжаются, пока растущие молекулы не перекрывают геном полностью. После этого для размножения полного генома используется обычная ПЦР. Чтобы превратить эти линейные геномы фага в способные заражать кольца, фермент PstI срезает по несколько нуклеотидов одной из цепочек на концах амплифицированных молекул. В результате на концах молекул образуются короткие одноцепочечные «хвосты». Они слипаются друг с другом, замыкая молекулу в кольцо.