Джеймс Уотсон - ДНК. История генетической революции

В идеале, чтобы знать «сценарий» жизни и видеть, как разворачивается действие «фильма» под названием жизнь, требуется открыть все мельчайшие изменения в составе белка, происходящие в процессе развитияособи, от оплодотворения до зрелой особи. На протяжении этого процесса действует множество белков, некоторые оказываются специфичны для конкретного этапа развития, поэтому в каждой фазе роста предстоит увидеть в действии различные совокупности белков. Например, гемоглобин зародыша и взрослой особи слегка различаются. Аналогично каждая разновидность ткани синтезирует собственные профильные белки.

Наиболее надежный способ отсортировать различные белки из имеющегося образца ткани – по-прежнему все тот же проверенный метод гельфореза с использованием двумерных гелей для разделения белковых молекул на основе различий их электрического заряда и молекулярной массы. Разделенные таким образом несколько тысяч белковых проб также можно проанализировать при помощи метода масс-спектрометрии, позволяющего исследовать состав белка на основании определения отношения массы к заряду ионов, образующихся при ионизации представляющих интерес компонентов пробы. Таким образом можно определять молекулярную последовательность каждой аминокислоты. Прошло более десяти лет после завершения проекта «Геном человека», а приблизительная карта человеческой протеомы еще не была построена. В 2014 году два консорциума наконец-то достигли этой цели. Проанализировав 30 разных тканей, они смогли каталогизировать 84 % белковых продуктов человеческого организма. В ходе этой работы были открыты сотни новых белков, в том числе продукты длинных, протяженных межгенных некодирующих РНК. С большой долей уверенности можно говорить, что каталог протеомики незаменим для понимания человеческого генома, хотя господствующая на сегодняшний день точка зрения – что информация передается от генома к РНК (транскриптома) и далее к белкам (протеома). Благодаря наличию новых данных, выложенных в открытый доступ, фармацевтические компании получили данные для работы на десятилетия вперед.

По сравнению с высокопроизводительной протеомикой, где применяются дорогое оборудование и автоматизация в промышленном масштабе, практическая транскриптомика на деле оказалась гораздо дешевле и проще: функционирование всех генов в геноме можно отследить, измеряя относительное содержание продуктов матричной РНК (мРНК) каждого из белков. Если вам интересно, какие гены экспрессируются, скажем, в клетках человеческой печени, вы выделяете образец мРНК из тканей печени. Получается «снимок» популяции мРНК в печеночной клетке: самые активные гены, транскрибируемые чаще всего и продуцирующие множество молекул мРНК, будут представлены более многочисленной популяцией, но если ген транскрибируется редко, в образце окажется всего несколько экземпляров его мРНК.

Ключом к транскриптомике стало на удивление простое изобретение под названием «ДНК-микрочип». Представьте себе стеклянную пластину размером 12,8 × 12,8 мм, на которую в виде сетки нанесены десятки или сотни тысяч крошечных точечных отверстий (они вытравлены в стекле). В эти отверстия с помощью микропипетки вносим последовательности ДНК от конкретного гена, они составят матрицу, в которой будет локализован один из генов человеческого генома. Критически важно, что мы знаем, где именно на этой пластине локализован каждый ген ДНК. Компания Affymetrix , расположенная близ Стэнфорда, смогла изготовить еще более миниатюрные чипы, вытравив их на кремниевой пластине такого размера, что применяются в небольших компьютерах. Так и получился «ДНК-чип». Ученый Марк Чи, основавший Affymetrix , также был сооснователем компании Illumnia , ставшей крупнейшим поставщиком на рынке таких микрочипов.

При помощи стандартных биохимических методов можно помечать печеночные мРНК химическим флуоресцентным маркером, так что вышеупомянутые белки обязательно будут флуоресцировать в ультрафиолете. На следующем этапе во всем своем великолепии проявляется вся сила и простота метода: просто сливаем наш образец мРНК на микрочип, где нас уже ждет миниатюрная пластинка с отверстиями, в которые уже внесены конкретные гены. Те самые связи, что возникают при спаривании оснований и удерживают вместе две нити двойной спирали, заставят каждую молекулу мРНК прикрепиться к тому гену, которому она комплементарна. Комплементарность точна и совершенно безошибочна: мРНК от гена X закрепится лишь в том отверстии в микрочипе, где находится ген X. На следующем этапе остается зарегистрировать флюоресценцию мРНК. На каких-то участках мы не увидим флюоресценции, и это будет обозначать, что комплементарной ему мРНК в образце не было. Следовательно, можно сделать вывод о том, что активной транскрипции этого гена в печеночных клетках не происходит. В то же время многие участки заметно флуоресцируют, некоторые – особенно интенсивно; это означает, что к ним прикрепилось множество молекул мРНК. Вывод: мы выявили очень активный ген. Таким образом, при помощи единственного экспериментального анализа мы идентифицируем все без исключения гены, активные в клетках печени. Такие молекулярные обзоры стали реальностью благодаря успешности проекта «Геном человека» и новому мировоззрению, которое проект привнес в биологию: исследователи больше не удовлетворяются изучением разрозненных фрагментов, они рассматривают полную картину генома во всей его великолепной красоте. Стоит ли удивляться тому, что Пэт Браун из Стэнфорда, один из ведущих практикующих специалистов, использующих этот метод, считает ДНК-микрочипы «новой разновидностью микроскопа».

Еще один эпохальный метод для изучения различных межбелковых взаимодействий ряд исследователей именует «интерактом». Название обозначает полный набор взаимодействий между молекулами в отдельнойклетке. Интерактом включает как непосредственные физические контакты между белками (белок-белковые взаимодействия), так и непрямые взаимодействия генов, это как минимум дважды гибридный метод. В 1989 году его разработал генетик из Университета штата Нью-Йорк в Стоуни-Брук Стэн Филдс, специализирующийся на инновационных научных технологиях, способных простимулировать научные открытия. В таком двухгибридном анализе смешиваются и стыкуются пары белков, и все происходит не на инертной матрице, а в живой дрожжевой клетке. Метод заключается в том, чтобы проанализировать взаимодействие белков in vivo в дрожжах путем связывания интересующих белков A и B с разделенными ДНК-связывающим и ДНК-активационным доменами некоторого активатора транскрипции. Конструкция «белок A + ДНК-связывающий домен» называется наживкой ( bait ), а конструкция «белок B + активационный домен» называется жертвой ( prey ). Если белки A и B взаимодействуют, то из двух фрагментов собирается функциональный активатор транскрипции, который запускает транскрипцию репортерного гена (например, вырабатывающего некий флуоресцентный белок), иначе репортерный ген не транскрибируется и сигнал не наблюдается, или, если конкретнее, когда интересующие нас белки связываются друг с другом, то активируется репортерный ген, обеспечивающий рост дрожжей.