М. Канунго - Биохимия старения

Культура клеток in vitro

Методы культуры ткани были значительно усовершенствованы за последние 20 лет, и сейчас можно изучать клетки в условиях, очень близких к физиологическим. Ткань изолируют и обрабатывают трипсином, разрушающим межклеточное вещество и освобождающим клетки, которые затем собирают центрифугированием. Известное число клеток помещают в стеклянные или пластиковые культуральные сосуды, содержащие среду, и инкубируют при 37 °C. При культивировании in vitro фибробластов легкого и кожи человека наблюдаются при четко различимые фазы. Через несколько часов после посева клетки прилипают к стеклянной поверхности и по прошествии 24–48 ч начинают делиться. Поверхность стекла через несколько дней покрывается дочерними клетками. Так образуется первичная культура. Период времени от высева исходных клеток до завершения образования монослоя называется фазой I.

После образования монослоя скорость деления клеток значительно уменьшается. Для получения больших количеств клеточной массы необходимо создать условия для дальнейшего роста клеток; Сначала удаляют среду, а затем добавляют трипсин, после чего клетки отстают от стекла. Часть суспензии клеток помещают в новые культуральные флаконы, на свободной поверхности которых клетки возобновляют деление. Обычно используют флаконы с одинаковой поверхностью. Если в этих условиях количество клеток, выращенных в двух новых флаконах, в 2 раза превышает их число в первичной культуре, т. е. происходит одно удвоение клеточной популяции, то принято обозначать частоту субкультивирования отношением 1:2. Точно неизвестно, делится ли один раз каждая клетка или только некоторые. При частоте субкультивирования 1:4 клеточная масса увеличивается в 4 раза, т. е. популяция удваивается дважды. Обычно, когда субкультивирование проводится с частотой 1:2, удвоение популяции достигается каждые 3–4 дня и за пять недель получают 2 10(1024) дочерних клеток.

Фибробласты легких и кожи человека быстро делятся и растут, если материалом для пересева служит суспензия клеток первичной культуры, которая прошла фазу I. Популяция эмбриональных клеток удваивается 40–60 раз. Это соответствует фазе II, которая характеризуется быстрым ростом клеток. Иногда в этой фазе может появиться несколько клеток, которые начинают непрерывно делиться. Поэтому желательно время от времени исследовать кариотип клеток. Любое отклонение кариотипа от исходного указывает на наличие трансформированных или раковых клеток. Однако, как правило, пролиферация клеток постепенно затухает после 40–60 удвоений популяции и полностью прекращается примерно после 50±10 удвоений популяции, после чего клетки разрушаются и погибают. Это фаза III, для которой характерно снижение пролиферации и развитие признаков старения клеток. Клетки этой фазы называются поздними пассажными клетками. Клетки стареют даже в том случае, если регулярно заменяется среда и питательные вещества имеются в достаточном количестве. В фазе III время образования монослоя становится больше, чем в фазе II, постепенно оно увеличивается еще больше, клетки перестают делиться и затем погибают (рис. 8.1).

Рис. 8.1. Диаграмма происхождения клеточных штаммов и феномена трансформации клеток в культуре [26]. Фаза I, первичная культура, завершается формированием первого монослоя. Фаза II характеризуется усиленным ростом, требующим частых пересевов. Когда культура достигает этой фазы, ее называют 'клеточным штаммом'. В результате какого-либо изменения может возникнуть клеточная линия с неограниченной продолжительностью жизни или клетки вступают в фазу III и погибают

Кроме снижения пролиферативной активности клеток в фазе III (рис. 8.2) изменяются некоторые метаболические параметры (табл. 8.1). Содержание одних ферментов снижается, других — повышается или остается прежним. Эти изменения сходны с теми, которые наблюдаются в различных органах животного in vivo при старении (гл. 3). Момент снижения пролиферативной активности легко регистрируется и принимается обычно за начальную точку фазы III, правда, некоторые изменения метаболических параметров возникают раньше уменьшения скорости деления. Несомненно, что репликация зависит от интенсивности метаболизма, снижение которой не может не отразиться на способности клеток к пролиферации. Холлидей иТаррент [28], а также Линн и др. [35] сообщили, что на поздних этапах фазы III легочные фибробласты человека MRC-5 содержат измененную ДНК-полимеразу, имеющую аминокислотные замены. По-видимому, именно этим объясняется уменьшение пролиферативной активности клеток. Оргел [39] предположил, что в ДНК-полимеразе старых клеток могут возникать ошибки, которые отрицательно сказываются на скорости деления. В структуре некоторых других ферментов, изученных к настоящему времени (в их числе РНК-полимераза), ошибки не обнаружены; это свидетельствует о том, что аминокислотные последовательности данных ферментов не изменяются при переходе клеток из фазы II в фазу III [13, 15, 30] (другие ссылки см. в гл. 9). Таким образом, наблюдаемое ослабление пролиферации, по-видимому, обусловлено только постепенным снижением синтеза ДНК-полимеразы.

Рис. 8.2. Зависимость количества клеток штамма WI-44 от длительности культивирования [24]. В течение первых 40 пассажей число клеток остается практически постоянным и составляет около 6·10 6на каждый пассаж при частоте субкультивирования 2:1. Начиная с 45-го пассажа, число клеток логарифмически падает (фаза III)

Таблица 8.1. Метаболические и клеточные параметры, которые снижаются, повышаются или не изменяются при старении интактных фибробластов человека in vitro [26]

Возрастные изменения клеток в культуре

С целью исследования причин старения организма было предпринято изучение старения клеток в культуре. Как впервые показали Свим и Паркер [48], фибробласты, полученные из различных тканей человека, пролиферируют только в течение ограниченного времени, после чего погибают. Эти авторы, однако, не выяснили, сохраняют ли клетки в культуре свои нормальные свойства, и не осмелились предположить, что их ограниченная пролиферативная активность связана со старением. Позже аналогичные работы были широко развернуты в лаборатории Хейфлика. Хейфлик и Мурхед [27] установили, что легочные фибробласты эмбриона человека проходят в культуре около 50 удвоений популяции и затем погибают. Фибробласты, полученные из легочной ткани взрослого донора, подвергаются только ~20 удвоениям популяции [24]. Хейфлик предположил, что имеется обратная зависимость между возрастом донора и пролиферативным потенциалом фибробластов. Позже другие исследователи [18, 34, 37, 43, 45] также сообщили о наличии такой связи (рис. 8.3). Более того, было показано, что при культивировании фибробластов кожи, полученных от людей в возрасте 10–90 лет, наблюдается снижение потенциала удвоения примерно на 0,20 относительные единицы в расчете на каждый год жизни донора. Коэффициент регрессии составляет -0,20 [37]. Сообщение Голдстейна и др. [19] о том, что не хронологический возраст донора, а скорее его физиологическое состояние ответственно за скорость роста фибробластов, побудило многих авторов проделать скрупулезную работу с клетками разных типов, чтобы установить, действительно ли существует линейная связь между хронологическим возрастом и удвоением популяции. Изучение культур фибробластов, источником которых служили клетки тщательно отобранных здоровых доноров, не предрасположенных к диабету, дало отрицательный результат: обратная зависимость между возрастам донора и числом удвоений популяции не была обнаружена. В то же время эта зависимость была установлена для культур клеток, полученных от больных диабетом или от лиц, генетически предрасположенных к этому заболеванию. Таким образом, именно физиологическое состояние в большей степени, чем хронологический возраст, определяет пролиферативную активность клеток.