Михаил Виленчик - Биологические основы старения и долголетия

Однако с помощью усовершенствованного А. Н. Хохловым и мной седиментационного метода анализа ДНК в культивируемых фибробластах человека нам удалось измерить количество повреждений ДНК, индуцируемых в процессе прогревания этих клеток при 44 °C. В эксперименте учитывались два существенных момента. Во-первых, в течение опыта клетки сохраняли жизнеспособность, т. е. можно было считать, что определяется процесс повреждения ДНК в живых клетках. И во-вторых, при температуре 44 °C происходит существенное ингибирование процесса репарации ДНК, а это означает, что при такой температуре аккумулируются тепловые повреждения ДНК.

Рассчитанной на основании полученных нами данных константе скорости образования тепловых повреждений ДНК соответствует точка 4 на рис. 5.

Спустя несколько лет после опубликования этих данных ряд исследователей в США также зарегистрировали повреждения ДНК в клетках млекопитающих, прогретых при температурах меньше 45 °C.

Несмотря на сложность анализа и в то же время его неполноту, можно с большой вероятностью утверждать: константа скорости теплового разрушения структуры ДНК лежит в пределах менее одного порядка, а именно в пределах 6·10 -11с -1до 3·10 -10с -1.

Другие пути оценок скоростей спонтанного разрыва связей пуринов с сахарными остатками в ДНК, основанные на анализе механизмов разрывов этих связей, также приводят к значениям их констант при 37 °C, лежащих в этом диапазоне. В том же диапазоне лежат и рассчитанные нами константы скоростей "спонтанного" разрыва полинуклеотидных цепей ДНК при физиологических условиях.

Но каков биологический смысл этих констант? Каким образом их знание приближает нас к пониманию механизмов старения? Без дополнительного количественного анализа ответить на эти вопросы невозможно.

Примерно каждую секунду в геноме каждой клетки человека спонтанно возникает одно повреждение ДНК. Чтобы "воспринять" приведенные константы, оценить значимость, казалось бы, ничтожно малых скоростей спонтанного возникновения в ДНК апуриновых участков и разрывов, рассчитаем число таких повреждений, возникающих в течение часа в геноме клетки человека и сравним эту величину с числом повреждений ДНК, индуцируемых в той же клетке ионизирующим излучением в дозе, вызывающей гибель значительной части облученных клеток. Такое сравнение ценно, и вот почему. Во-первых, основную "массу" повреждений ДНК, индуцируемых ионизирующим излучением, составляют также разрывы полинуклеотидных цепей или участки ДНК, из которых выщеплены пуриновые или пиримидиновые основания. Во-вторых, из многочисленных данных радиобиологии следует, что такого рода повреждения ДНК или их комбинации (в частности, образование из двух однонитевых разрывов, локализованных в комплементарных цепях вблизи друг друга, "полного" (двойного) разрыва двойной спирали ДНК) ответственны за биологические эффекты излучений. И в-третьих, содержание ДНК в нормальной клетке человека существенно не отличается от содержания в нормальных клетках других млекопитающих. Таким образом, наша количественная оценка скорости возникновения тепловых повреждений ДНК в клетках человека и ее значения будет справедлива и для клеток различных млекопитающих.

В геноме каждой клетки возникает одно повреждение ДНК в секунду. Согласно данным различных работ ДНК в каждой диплоидной клетке человека содержится около 7·10 9пар оснований. Примерно столько же пар оснований содержится в ДНК соматической клетки других видов плацентарных млекопитающих. Таким образом, в расчете на ДНК диплоидной клетки человека скорость депуринизации можно принять соответствующей выщеплению в течение часа 2500 пуриновых оснований.

Поскольку процесс образования спонтанных однонитевых разрывов, как правило, лимитируется на этапе депуринизации ДНК, то, следовательно, скорость образования спонтанных однонитевых разрывов должна быть такого же порядка, что и скорость депуринизации ДНК. Подчеркнем однако, что сказанное верно лишь в отношении тепловых разрывов ДНК.

Но часть разрывов ДНК возникает в клетке вследствие реакции с ДНК эндогенных метаболитов радикалов ОН· и O 2, а также Н 2О 2, перекисей липидов ионов металлов с переменной валентностью. Кроме того, часть "спонтанных" разрывов ДНК обусловлена "ошибками" в работе ферментов (ДНКаз) и их "незапрограммированным" взаимодействием с ДНК. Таким образом, в зависимости от типа клеток и их физиологического состояния общая частота возникновения "спонтанных" разрывов в ДНК клеток человека, вероятно, в той или иной степени превышает значение 2·10 3в час.

Количество повреждений ДНК такого типа, спонтанно возникающих в животных клетках в течение часа, примерно равно числу повреждений ДНК, индуцируемых в этих же клетках облучением их рентгеновским или γ-излучением в дозе 2,5–5 Гр (или 250–500 рад). Но при такой дозе облучения значительная часть клеток млекопитающих гибнет, а в организме этих животных обнаруживают изменения физиологических процессов.

Что касается скоростей возникновения других классов спонтанных повреждений ДНК in vivo, то определить их гораздо труднее. Межцепочечные сшивки в ДНК образуются в местах ее депуринизации, вероятно, с частотой в 10 -2-10 -3от частоты депуринизации. Иными словами, в течение суток в геноме каждой диплоидной клетки человека образуется порядка 60-600 сшивок между обеими цепями ДНК. Скорость выщепления пиримидиновых оснований в расчете на геном диплоидной клетки человека, вероятно, примерно в 20 раз меньше скорости выщепления пуриновых оснований. Во всяком случае, соотношение скоростей выщепления пиримидиновых и пуриновых оснований из ДНК, находящейся в растворе, примерно таково. Следовательно, число пиримидиновых оснований, спонтанно выщепляемых из ДНК диплоидной клетки человека, может составлять около 3·10 3за сутки. Это количество весьма существенное.

Сравнение на основании данных константы скорости спонтанного дезаминированного цитозина в растворе при рН 7 и при относительно высокой температуре с расчетным значением константы скорости депуринизации ДНК при той же температуре и том же рН показывает, что скорость спонтанного дезаминирования цитозина может быть даже больше, чем скорость депуринизации. Но последняя согласно приведенным выше расчетам соответствует выщеплению из ДНК в течение суток (в расчете на геном диплоидной клетки млекопитающих) порядка сотни тысяч аденина или гуанина. Следовательно, возможно, что скорость дезаминирования цитозина в ДНК составляет порядка 10 5в течение суток в расчете на геном клетки млекопитающих. Если это так, рассматриваемое спонтанное изменение ДНК также нужно считать биологически очень существенным, учитывая резкое изменение матричных свойств цитозина после его дезаминирования.