Максим Франк-Каменецкий - Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века

Если далее локализовать место разрыва на молекуле ДНК, то оказывается, что эндонуклеаза наносит разрыв в точности в центре главного палиндрома. Такие опыты, проведенные впервые Виктором Лямичевым и Игорем Панютиным все в том же Институт молекулярной генетики АН СССР, окончательно рассеяли всякие сомнения в том, что кресты действительно самопроизвольно возникают в ДНК при достаточной отрицательной сверхспирализации. Эти опыты также продемонстрировали, что наши теоретические предсказания вероятности образования крестов в сверхспиральных ДНК верны количественно.

Рис. 32.Типичная картина двумерного гель-электрофореза, наблюдаемая при образовании в ДНК крестообразных или других альтернативных структур, о которых речь будет идти в главе 9. Специально приготовленная смесь различных топоизомеров одной и той же ДНК, несущей вставку, способную переходить в альтернативную структуру, была помещена в левый верхний угол квадратной пластинки геля. Затем было приложено электрическое поле так, чтобы молекулы ДНК двигались сверху вниз вдоль левого края пластинки. После завершения разделения топоизомеров в первом направлении гель насыщали молекулами хлорокина, которые уменьшают сверхспиральное напряжение. Концентрацию хлорокина подбирали с таким расчетом, чтобы сверхспирального напряжения было недостаточно для образования альтернативной структуры. Затем направление электрического поля меняли так, чтобы молекулы двигались слева направо. В результате последовательность пятен во втором направлении соответствовала последовательности топоизомеров.

Самое верхнее пятно отвечает нулевому топоизомеру, т. е. релаксированной, несверхспирализованной ДНК. Пятна, следующие от этого пятна по часовой стрелке, отвечают положительным топоизомерам, а те, что против часовой стрелки, – отрицательным. Ясно виден скачок подвижности, наблюдающийся в данном случае между топоизомерами –10 и –12. Это означает, что в топоизомерах –12, –13,… альтернативная структура присутствует, а в топоизомерах…, –9, –10 она отсутствует. Топоизомер –11 занимает промежуточное положение – в нем альтернативная структура то образуется, то исчезает

Какова роль крестов в ДНК? Пока об этом ничего не известно. Думают, что крестообразные структуры могут служить местами посадки на ДНК каких-то белков. Во всяком случае кресты – это первый надежно доказанный пример того, что структура отдельных участков биологически активной ДНК может существенно нарушаться при условиях, близких к тем, в которых ДНК функционирует в живой клетке. Насколько важную роль играют эти и, возможно, другие нарушения, о которых будет рассказано в главе 9, в работе ДНК в клетке – это вопрос дальнейших исследований.

Эволюция – бездарный инженер. Она действует методом тыка или, выражаясь по-научному, методом проб и ошибок. Эволюцию не заботят отдаленные последствия принятых решений, лишь бы как-то решить сиюминутную проблему. Она не считается с гибелью почти всех ради выживания немногих, лишь бы выжившие еще протянули. Такая недальновидная инженерия сплошь и рядом заводит в эволюционные тупики, приводит к полному вымиранию целых видов. Можно лишь поражаться, что такой бездарный инженер создал все это буйство жизни, которое нас окружает, и нас самих, способных оценить степень бездарности нашего создателя. И в дополнение к своей собственной бездарности эволюции приходится работать в условиях строгих ограничений, налагаемых изначально избранной химической природой главных биологических молекул, прежде всего ДНК и РНК.

Эта химическая природа диктует жесткие правила, которым должны подчиняться процессы синтеза самих этих молекул. Одиночная цепь ДНК (и РНК) имеет химически заданное направление, т. е. концы различны. Конец, который принято считать началом цепи, обозначают как 5 и называют «пять-штрих конец». Противоположный конец обозначают как 3 и называют «три-штрих конец».

В двойной спирали цепи антипараллельны, т. е. направлены навстречу друг другу.

Так вот, цепи ДНК (и РНК) могут удлиняться только с 3 -конца, точнее с 3 -концевой гидроксильной группы OH. Удлинение производится при помощи специальных ферментов: ДНК – и РНК-полимераз. Ну это для читателя не новость, об этих ферментах уже много говорилось выше. Напомним, что, чтобы вести синтез, полимеразам необходимы четыре предшественника нуклеотидов и матрица (цепь ДНК или РНК), чтобы полимераза знала, какой нуклеотид ставить следующим. Эволюция привнесла еще одно существенное ограничение или, если хотите, ляп. ДНК-полимераза не способна начать синтез ДНК, имея только матрицу: ей еще подавай затравку (называемую праймером) с 3 -концевой OH-группой, иначе она работать категорически отказывается. Это свойство всех ДНК-полимераз (и ревертаз). РНК-полимеразы не столь привередливы, им достаточно матрицы, чтобы начать синтез. Кстати, ДНК-полимеразе безразлична химическая природа праймера (ДНК или РНК), лишь бы была 3 -концевая OH-группа. Одиночная цепь ДНК с сидящим на ней праймером выглядит так:

Вот на этой конструкции ДНК-полимераза работает с большим удовольствием, быстро и практически без ошибок превращая ее в такую:

Проблема праймирования уже обсуждалась нами в главе 5 в связи с секвенированием ДНК методом Сэнгера. В лаборатории эта проблема решается просто: вы заказываете нужный праймер в одной из множества фирм, синтезирующих кусочки ДНК (олигонуклеотиды) по заказу. Праймеры почти ничего не стоят, и их делают очень быстро. Это прекрасно, но как же быть клетке, если ей необходимо реплицировать свою ДНК? Тоже прикажете в фирму обращаться? Наш инженер вроде бы нашел выход из положения. Он приспособил к делу РНК-полимеразу, благо ей праймер не нужен. Такая РНК-полимераза, которая играет в клетке роль фирмы по синтезу РНКовых праймеров, называется праймазой. Вот вам и еще один пример былого величия РНК.

Может, наш инженер не так уж глуп, просто, когда еще в эпоху предбиологической эволюции впервые понадобилась ДНК-полимераза, проще оказалось воспользоваться уже готовой РНК-полимеразой, чем создавать ДНК-полимеразу, способную работать без праймера. Да, возможно, наш инженер и не глуп, но уж точно недальновиден. Проблема с репликацией ДНК все-таки возникла, причем серьезнейшая. Скорее всего, не сразу, а гораздо позже, в ходе биологической эволюции, когда что-либо изменить в ДНК-полимеразе было уже невозможно – все поломаешь. В чем же проблема?