Максим Франк-Каменецкий - Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века

Эти данные вместе с другими аргументами, которые мы здесь опустим, не оставляли сомнений в том, что Уонгу и его сотрудникам действительно удалось завязать однонитевую молекулу ДНК в узел. И таких молекул было в препарате множество – около 90 %. «Но позвольте, – скажете вы, – эти данные никак не согласуются с теоретическими расчетами, о которых шла речь выше!» Действительно, никак нельзя было ожидать столь большой эффективности образования узлов в однонитевых ДНК.

Уонг очень эффектно объяснил это противоречие. По его мнению, в тех условиях, в каких шел эксперимент, никак нельзя уподоблять однонитевую ДНК простой свободно-сочлененной цепочке, как это делалось в упомянутых расчетах. В любой достаточно длинной последовательности нуклеотидов всегда есть комплементарные участки, которые находят друг друга, образуя короткие спирали.

Конечно, дело не ограничивается спиральными участками. Однонитевая ДНК склонна принимать весьма причудливую пространственную конфигурацию. При этом замкнутость цепи в кольцо неизбежно вызывает напряжения, которые могли бы исчезнуть, будь кольцо разомкнуто.

Связывается топоизомераза, скорее всего, со спиральными участками, раскусывает одну нить, после чего вокруг другой, нетронутой нити может начаться свободное вращение одной части молекулы относительно другой. При этом снимается внутреннее напряжение – происходит релаксация. Далее топоизомераза вновь сшивает разорванную нить, закрепляя новое состояние молекулы. Дело сделано – узел готов.

Вопрос об узлах в однонитевой нуклеиновой кислоте вновь стал актуальным в самое последнее время. Неожиданно в нервных клетках был обнаружен новый тип молекул РНК: кольцевые однонитевые РНК, или циркулярные РНК (циркРНК). Их роль до конца неясна, но, по-видимому, они как-то участвует в развитии нервной системы. Считается, что преимуществом циркРНК является их устойчивость к экзонуклеазам. После первых сообщений об обнаружении кольцевых РНК, я опубликовал заметку под заголовком «Топология РНК», в которой поставил вопрос об узлах в таких молекулах и, соответственно, о существовании РНК-топоизомераз. И действительно, РНК-топоизомеразы были вскоре обнаружены. Пока не было сообщений об обнаружении заузленных молекул циркРНК.

Итак, впервые молекулу завязали в узел. То, что было не под силу химикам-синтетикам, удалось молекулярным биологам. Конечно, это было только начало. Было очень заманчиво завязать в узел двухнитевую ДНК. Сделать это в принципе нетрудно. Наиболее подходящим объектом казалась ДНК бактериофага λ.

Этот фаг был излюбленным объектом изучения в фаговой группе, собранной в свое время Дельбрюком. Когда возникла молекулярная биология, он стал вместе со своей клеткой-хозяйкой (кишечной палочкой) главным полигоном для изучения репликации, транскрипции, организации генов.

Внутри фаговой частицы ДНК фага λ линейна, но у нее есть «липкие» концы – однонитевые взаимно комплементарные участки, содержащие по 12 нуклеотидов, т. е. она выглядит примерно так:

Если такой ДНК дать возможность свободно плавать в растворе, то «липкие» концы сомкнутся и ДНК превратится в кольцо. Поскольку эта молекула довольно длинная (в ней около 50 тысяч пар нуклеотидов), то при замыкании в кольцо она с довольно высокой вероятностью завяжется в узел.

Вспомним, что двухцепочечная ДНК – это очень жесткая цепь, один ее сегмент содержит около 300 пар оснований. Поэтому оценивать вероятность образования узла в двунитевой ДНК можно с помощью графика, приведенного на рис. 36 и основанного на компьютерных расчетах. По нему выходит, что около половины молекул ДНК фага λ при замыкании должны образовать узлы. Беда в том, что для такой длинной ДНК очень трудно отличить нетривиальный узел от тривиального. Во всяком случае пока это сделать не удалось. Липкие концы нужны ДНК фага λ как раз для того, чтобы замыкаться в кольцо, попадая в клетку-хозяйку. Если она не замкнется, то не сможет реплицироваться и вообще нормально работать (если, конечно, можно назвать работой тот разбой, который она учиняет, попав в кишечную палочку).

И вот тут возникает вопрос, на который необходимо найти ответ. А что будет, если при замыкании в кольцо ДНК завяжется в узел – ведь теория показывает, что это вполне вероятно? Не повредит ли это ее работе в клетке? Ведь вирусная ДНК должна произвести множество копий самой себя. Если завязывание в узел мешает этому, то, значит, в клетке должны существовать специальные механизмы, препятствующие образованию узлов. Но что это за механизмы?

Убедиться в том, что ДНК, завязанной в узел, будет трудно удваиваться, вы можете сами. Возьмите полоску бумаги и склейте из нее нетривиальный узел, например трилистник. Затем ножницами разрежьте полоску вдоль, на две половины. Это будет моделировать удвоение ДНК, во всяком случае один из возможных вариантов удвоения. Вы увидите, что вам не удастся развести два образовавшихся узла. Эти вопросы были подняты нами в уже упоминавшейся статье в журнале Nature . Ответ пришел спустя пять лет.

В 1980 году Л. и Ч. Лю и Б. Олбертс сообщили, что после многолетних поисков им удалось наконец подобрать условия, в которых обычная двунитевая ДНК образует узлы. Они работали не с ДНК фага λ, в которой узлы трудно обнаружить из-за большой длины, а с короткими кольцевыми молекулами. Оказалось, что если к таким молекулам добавить одну из топоизомераз в большом избытке, то очень эффективно идет образование узлов. Об их возникновении можно судить по тому, что в геле при электрофорезе появляются фракции ДНК с большой подвижностью. Авторы пошли дальше – обработали заузленные молекулы топоизомеразой, но взятой в низкой концентрации и в присутствии АТФ. Что же произошло? Узлы развязывались!

Последнее событие произошло в полном соответствии с теорией, так как использовавшаяся ДНК была короткой и равновесная доля узлов в ней не должна была превышать 5 %.

Образование узлов при избытке фермента вызвано, по-видимому, тем, что белок, связываясь с ДНК, меняет физические свойства молекулы, прежде всего усиливает слипание удаленных вдоль цепи звеньев. Как показывают расчеты, такое слипание должно резко увеличивать вероятность образования узла.

Открытие американских ученых вызвало целый поток аналогичных публикаций. Немедленно для получения узлов были применены методы генной инженерии.

Итак, топоизомеразы явно делились на две группы. Одни делают узлы на однонитевых ДНК. Их стали называть топоизомеразами I, другие специализируются на двунитевых молекулах, их назвали топоизомеразами II.