Максим Франк-Каменецкий - Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века

Проблема была бы решена, если бы удалось все же получить кристаллы из ДНК, исследовать рассеяние рентгеновских лучей от этих кристаллов, а потом строго решить обратную задачу восстановления структуры по картине рассеяния. Именно так определяют пространственное строение обычных химических соединений любой сложности, а также белков. Но для ДНК это сделать не удавалось.

Ясно, что для длинных молекул или для коротких молекул, имеющих разную длину или разную последовательность, нет шансов получить кристаллы. Надежда была на то, что если взять короткие молекулы, содержащие около 10 пар оснований и имеющие одинаковую длину и последовательность, то их удастся как-то закристаллизовать.

Но получение кристаллов – это весьма кропотливое дело. Нужно варьировать маточный раствор, из которого ведется кристаллизация, так что требуются очень большие количества вещества. А где взять много кусочков ДНК строго заданной длины? Такие препараты стали доступны только в конце 1970-х годов благодаря потрясающим успехам в химическом синтезе ДНК с заданной последовательностью.

Успехи химиков в этой области действительно поражают. В свое время синтез Кораной троек нуклеотидов разной последовательности вызвал сенсацию и в конечном счете принес автору Нобелевскую премию. (Как, возможно, помнит читатель, эти тринуклеотиды позволили провести полную расшифровку генетического кода, см. главу 2.) К началу 1980-х годов стало возможным заказать небольшой ящик размером с пишущую машинку. На ящике кнопки с буквами А, Т, Г, Ц. Вы нажимаете кнопки в том порядке, какую вы хотите получить последовательность (но не более 20 нуклеотидов), засыпаете в ящик исходные ингредиенты, также выпускаемые промышленностью, и идете обедать. Потом вы можете сходить в библиотеку или на семинар, а вернувшись через несколько часов, обнаружите в выходном устройстве вашего ящика несколько миллиграммов препарата, который вы заказали. Но в последние годы народ совсем обленился. Теперь эти чудо-приборы пылятся на полках или, скорее всего, вообще выброшены на свалку, а кусочки ДНК нужной последовательности заказывают по Интернету на одной из множества фирм по смехотворной низкой цене.

Так или иначе, больше не существует проблем, связанных с искусственным синтезом гена. Из синтетических олигонуклеотидов можно при помощи лигазы сшить ген любой длины. Это решает также проблему получения в больших количествах коротких кусков ДНК для их кристаллизации. Впрочем, машины, синтезирующие куски ДНК, появились в самом начале 1980-х годов, но в конце 1970-х в некоторых лабораториях, занимавшихся синтезом генов, уже умели быстро синтезировать лоскутки ДНК, правда, вручную.

Впервые хорошие кристаллы маленьких кусочков ДНК удалось получить в 1979 году в лаборатории Александра Рича (Массачусетский технологический институт). Кристаллы были из гексануклеотидов:

Каково же было удивление Рича и его сотрудников, когда, проделав все необходимые очень трудоемкие процедуры, они получили наконец структуру своих кусочков. Эта структура не имела ничего общего с моделью Уотсона и Крика!

Нет, разумеется, у нее были нормальные пары ГЦ, и даже кусочек образовывал отрезок двойной спирали, но на виток спирали приходилось не 10, а 12 пар оснований. Но главное не это. Главное, что спираль была не правая, как в В-форме, а левая!

Имелся еще целый ряд принципиальных отличий этой новой структуры, названной авторами Z-формой, от В-формы ДНК. Название происходит от того, что, в отличие от В-формы, в которой сахарофосфатный остов образует плавную винтовую линию, в Z-форме эта линия имеет зигзагообразный вид (рис. 41).

Что же получается, неужели все-таки модель Уотсона—Крика оказалась в конечном счете неверной? Ведь первая же структура ДНК, найденная с помощью абсолютно надежных методов рентгеновской кристаллографии, оказалась принципиально отличной от В-формы.

Нет, открытие американских ученых при всей своей сенсационности не носит столь радикального характера. Опыты с кольцевыми ДНК однозначно свидетельствуют о том, что спираль ДНК в растворе правая и на виток спирали приходится 10 пар, что соответствует В-, а не Z-форме. Так что же, значит, в кристалле вследствие межмолекулярных взаимодействий структура двойной спирали столь сильно меняется? Нет, дело и не в этом.

Как удалось установить, тому, что изученный гексануклеотид оказался в Z-форме, способствовала главным образом строго чередующаяся последовательность Г и Ц.

Вскоре Р. Диккерсон и его сотрудники из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе определили структуру в кристалле ДНК другой последовательности:

Оказалось – В-форма. Стали изучать переход ДНК в Z-форму в растворе. Выяснилось, что при обычных условиях, по крайней мере в линейной ДНК, Z-форма не образуется. Ну а в сверхспирализованной?

Рис. 41.Так выглядят объемные модели Z– и В-формы ДНК. Черные линии нарисованы, чтобы показать ход сахарофосфатной цепи

Конечно, сверхспирализация должна делать Z-форму более выгодной, так как изменение знака спирали из положительного на отрицательный в отрезке ДНК снимает напряжение в остальной части отрицательно сверхспирализованной молекулы. Поэтому вполне естественно предположить, что в сверхспирализованной ДНК участки, имеющие чередующуюся последовательность Г и Ц, будут переходить в Z-форму. Так ли это?

Ответ на этот вопрос зависит от того, какова энергия перехода В – Z для участка, имеющего последовательность …ЦГЦГЦГЦГЦГ… Ведь помимо регулярной В-формы образование Z-формы должно стать более выгодным, чем образования креста, чтобы эта форма существовала. Ведь последовательность

это перевертыш, так что вопрос о том, переходят ли участки ДНК с подходящей последовательностью в Z – форму, совсем не прост. Его необходимо было исследовать экспериментально.

Как и в случае с крестами, наиболее эффективным методом выяснения вопроса о том, образуется ли Z-форма в отрицательно сверхспирализованной ДНК, оказался метод двумерного гель-электрофореза (см. главу 7). Только достаточно длинные участки …ЦГЦГЦГЦГ… в обычных плазмидах не встречаются. Поэтому потребовалось конструирование специальных плазмид, несущих искусственные вставки …ЦГЦГЦГЦГ… разной длины.

Дж. Уонг впервые применил к исследованию Z-формы метод двумерного гель-электрофореза. Исследуя плазмиды с длинными вставками …ЦГЦГЦГЦГ…, он наблюдал картинки типа приведенной на рис. 32 в условиях, когда для контрольной плазмиды, лишенной вставки, никакого разрыва на электрофореграмме не наблюдалось. Это означало, что наблюдаемый структурный переход происходил во вставке …ЦГЦГЦГЦГ… Но что при этом возникало – крест или Z-форма? Ответ на этот вопрос могла дать величина скачка, т. е. то, на сколько топоизомеров вверх происходил скачок при переходе. Если бы происходил переход в крест, то следовало ожидать скачок на т/ 10,5 топоизомеров, где т – число пар в перевертыше, т. е. в последовательности …ЦГЦГЦГЦГ… В случае же образования Z-формы следовало ожидать скачка на т (1/10,5 + 1/12,5) топоизомеров (12,5 – это число пар, приходящихся на виток левой спирали ДНК в Z-форме). Эксперимент дал четкий ответ – величина скачка отвечала образованию Z-формы, а не креста. Так было показано, что последовательности …ЦГЦГЦГЦГ… могут переходить в Z-форму в условиях, близких к физиологическим. Это позволяло надеяться, что Z-форма может возникать в ДНК внутри клетки и играть какую-то биологическую роль.