Максим Франк-Каменецкий - Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века

Образование Z-формы в ЦГ-последовательностях при отрицательной сверхспирализации ДНК можно регистрировать не только методом двумерного гель-электрофореза. Другой метод, широко применявшийся А. Ричем с сотрудниками, состоит в использовании антител к Z-форме. Эти антитела были получены путем иммунизации животных химически модифицированным ЦГ-полимером, который находится в Z-форме при любых условиях. Такие антитела не связываются с ДНК или ЦГ-полимером в В-форме, но сильно связываются с ЦГ-полимером, находящимся в Z-форме. Было показано, что искусственные плазмиды, несущие ЦГ-вставки, начинают связывать антитела к Z-форме, когда их отрицательная сверхспирализация становится достаточно высокой.

Анализ пространственной структуры Z-ДНК привел к заключению, что для этой формы ДНК важно регулярное чередование пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов в каждой из комплементарных цепей. Если такого чередования нет, то Z-форма становится сильно невыгодной по сравнению с В-формой. Поэтому можно было ожидать, что наряду с последовательностями …ЦГЦГЦГ… отрицательная сверхспирализация будет способствовать образованию Z-формы еще в двух простых пурин-пиримидиновых последовательностях:

и

Выяснение этого вопроса было особенно важно потому, что протяженные участки с такими последовательностями сравнительно часто встречаются в эукариотических ДНК. Были сконструированы специальные плазмиды, несущие такие вставки, и проведены опыты по двумерному гель-электрофорезу, связыванию антител к Z-форме, расщеплению однонитевой эндонуклеазой. Эти опыты показали, что, как и ожидалось, ГТ-вставки переходят в отрицательно сверхспирализованной ДНК в Z-форму (образование крестов в таких последовательностях, очевидно, невозможно), а вот АТ-вставки образуют кресты.

Открытие Z-формы буквально всколыхнуло души молекулярных биологов. Вместе с доказательством существования крестов в сверхспиральных ДНК это открытие показало, что, хотя в целом ДНК, безусловно, находится в В-форме, отдельные ее участки могут иметь резко отличающуюся структуру. Начался поиск этих и других структур в ДНК и выяснение их возможной биологической роли.

В ходе работы по выяснению возможной биологической роли альтернативных (отличных от В-формы) структур наиболее популярным оказался ферментативный метод, так как он прост и позволяет локализовать на ДНК место атаки однонитевой эндонуклеазы. Дэвид Лилли (Университет Данди, Великобритания) показал, что кресты атакуются в центре перевертыша, а Роберт Уэллс (Алабамский университет, США) обнаружил, кроме того, что при образовании Z-формы атакуются границы между ней и В-формой.

Генные инженеры, встраивая все новые и новые участки ДНК из самых разных организмов в плазмиды, стали проверять их на чувствительность к однонитевой эндонуклеазе в надежде обнаружить кресты или Z-форму. Действительно, некоторые участки ДНК из высших оказывались очень чувствительными к ферменту. Они получили название гиперчувствительных мест. Когда удалось локализовать эти места, выяснилось, что они всегда находятся в важных регуляторных участках генома. Это привлекло к ним еще большее внимание. Когда же были определены их последовательности, то, к большому смущению исследователей, оказалось, что они – не перевертыши и не чередующиеся пурин-пиримидиновые участки. Как правило, гиперчувствительными к однонитевой эндонуклеазе оказывались последовательности, которые в одной цепи содержат только пурины, а в другой – только пиримидины, т. е. гомопурин-гомопиримидиновые последовательности типа (Г)n•(Ц)n или (ГА)n•(ТЦ)n.

Как же это следовало понимать? Может быть, однонитевая эндонуклеаза предпочтительно атакует такие последовательности, даже если они находятся в нормальной В-форме? Или эти последовательности способны принимать в сверхспиральной ДНК какую-то новую, до сих пор не обнаруженную форму ДНК?

Последняя возможность была особенно интересной, поскольку это означало бы, что мы еще не знаем о структуре ДНК что-то очень важное, причем это «что-то» могло оказаться существенным для функционирования ДНК в клетках эукариот. Специалисты по структуре ДНК взялись за работу, пытаясь выяснить образуют ли гомопурин-гомопиримидиновые последовательности альтернативную структуру, а если образуют, то какую именно.

Возможно, рассуждали одни, эти последовательности могут образовывать левую спираль, не Z-форму, а какую-то другую левоспиральную форму, одну из тех, что можно построить с помощью молекулярных моделей. Нет, возражали другие, все дело в том, что это очень однородные последовательности и поэтому две комплементарные нити могут проскальзывать друг относительно друга, образуя две однонитевых петли по краям гомопурин-гомопиримидинового участка. Однонитевая эндонуклеаза атакует эти петли, что и делает такие последовательности гиперчувствительными. А может быть, указывали третьи, такие последовательности образуют четверные спирали, еще одну гипотетическую структуру, предложенную теоретиками на основе «игры» с молекулярными моделями. Однонитевая эндонуклеаза атакует вершину такой структуры, где должны быть однонитевые петли.

Очень скоро стало ясно, что сам по себе факт гиперчувствительности к однонитевой эндонуклеазе мало что дает, тем более что оставался открытым вопрос об избирательном действии самого фермента. В начале 1985 года В. Лямичев, С. Миркин и автор этих строк (мы тогда работали в Москве, в Институте молекулярной генетики [3]) решили применить к исследованию этого запутанного вопроса метод двумерного гель-электрофореза.

Была сконструирована плазмида, несущая последовательность (ГА) 16•(ТЦ) 16. Топоизомеры этой плазмиды были подвергнуты разделению методом двумерного электрофореза. На картинах электрофореза наблюдались характерные разрывы, как в случае крестов и Z-формы. Эти разрывы отсутствовали в контрольных экспериментах с плазмидой, в которую не был встроен участок (ГА) 16•(ТЦ) 16. Пятна, отвечающие следующим за разрывом топоизомерам, исчезли из картин двумерного фореза после обработки плазмиды со вставкой однонитевой эндонуклеазой. Эти опыты показали, что под действием отрицательной сверхспирализации в гомопурин-гомопиримидиновой последовательности на самом деле образуется некая альтернативная структура. Но, может быть, образуется одна из уже известных альтернативных структур, крест или Z-форма, просто требования к последовательности на самом деле не столь строги, как принято считать?