Александр Панчин - Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей

Место начала считывания РНК у бактерий определяется так: за 10 нуклеотидов до него должен быть участок с последовательностью, похожей на TATAAT, а за 35 нуклеотидов – участок, похожий на TTGACA. У эукариотических организмов все сложнее, и мы поговорим о них позже.

В предыдущем примере генной инженерии нас не волновало наличие промотора, ведь у исходного гена, к которому пристроили ген зеленого флуоресцентного белка, бактериальный промотор уже был. Промотор должен быть перед любым местом в геноме, с которого считывается РНК. Но у нашего гена медузы нет собственного бактериального промотора, и вставили мы его в произвольное место, а не туда, где он непременно есть. Необходимый промотор проще всего вставить сразу вместе с геном. Берем бактерий, выделяем из них ДНК, вырезаем из этой ДНК участок промотора, присоединяем промотор к гену медузы, а затем вставляем всю конструкцию в геном живой бактерии. Альтернативно промотор или конструкцию целиком можно синтезировать на специальном химическом синтезаторе.

Теперь у нас в романе “Война и мир" появились чистокровные марсиане. “Андрей Болконский проснулся и выглянул в окно. За окном находился огромный металлический цилиндр. Большая сероватая круглая туша, величиной, пожалуй, с медведя, медленно, с трудом вылезала из цилиндра", а продолжение вы знаете.

Давайте теперь усложним задачу. Мы хотим, чтобы флуоресцентные белки медузы появлялись в тех бактериях, которых мы покормили сахаром, а точнее конкретным видом сахара – лактозой. Для этого нам потребуется несколько дополнительных генетических конструкций, которые мы позаимствуем у кишечной палочки. Сначала мы добавляем к гену флуоресцентного белка регуляторную последовательность – оператор. Когда оператор свободен, синтез белка происходит, а когда оператор заблокирован, зеленый белок не появляется. Дополнительно мы встраиваем еще один ген, кодирующий белок-репрессор. Этот белок может связываться с оператором и таким образом останавливать синтез зеленого белка. Механизм действия репрессора такой: он мешает РНК-полимеразе присоединиться к молекуле ДНК, что предотвращает синтез РНК. Нет РНК – нет белка.

Мы выбрали не простой репрессор. Как у любого героя романа, у него есть слабость – он любит лактозу и изменяет с ней оператору. Когда в клетке есть лактоза, репрессор связывается с этим сахаром. Оператор остается одиноким, и РНК-полимераза спокойно синтезирует РНК. Когда лактозы нет, репрессор возвращается к оператору и блокирует синтез РНК нашего гена. Поэтому клетка будет светиться зеленым, если в среде есть лактоза, но не будет светиться, если лактозы нет. Так мы получили светящийся датчик лактозы в виде генетически измененной бактерии. Остается лишь поместить бактерию под специальный микроскоп.

Ген белка репрессора и последовательность оператора были лишь обнаружены человеком, но придуманы они были природой. Кишечная палочка использует описанную выше систему, для того чтобы регулировать работу некоторых собственных генов. Когда лактозы много, кишечная палочка производит белок, который расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу – два других сахара. Когда лактозы нет, экономной бактерии не нужен этот фермент, и белок-репрессор помогает остановить его синтез.

Давайте и в нашей версии романа “Война и мир" поставим оператор с репрессором. Скопируем перед описанием сцены с марсианами длинный авторский монолог из четвертого тома. Обычный человек, дойдя до этого монолога, уснет и ничего не узнает про марсиан. Но если он вооружится чашечкой крепкого кофе, возможно, сон удастся отогнать, и читатель осилит текст до конца. В нашей конструкции кофе играет роль лактозы у бактерий, сон – роль репрессора, а монолог – роль оператора, навлекающего сон. Нет кофе – нет истории про марсиан.

Можно предложить и другое сравнение. ДНК – это рельсы, по которым едет поезд – молекула РНК-полимеразы. Оператор – это место, где установлен шлагбаум, репрессор – это сам шлагбаум, а роль лактозы выполняет работник, управляющий шлагбаумом. Этот работник – человек важный, поэтому, когда его нет на службе, шлагбаум на всякий случай опущен и поезд вынужден стоять и ждать неопределенное время. Но когда работник возвращается, шлагбаум поднимается. Единственное биологически важное уточнение заключается в том, что репрессор на самом деле не столько мешает РНК полимеразе двигаться по ДНК, сколько не дает ей “встать на рельсы", соединиться с промотором. Поэтому промотор и оператор, как правило, находятся очень близко.

Благодаря различным операторам и репрессорам бактерии могут включать и выключать свои гены в зависимости от условий окружающей среды, от наличия питательных веществ, температуры и так далее. Когда мы говорим о многоклеточных организмах, например о растениях или животных, все становится несколько сложнее. Во всех клетках взрослого растения приблизительно одинаковая ДНК (с небольшими отличиями из-за случайных мутаций), но клетки могут быть совершенно разными. Одни клетки расположены в листьях, и им нужно производить много белков, участвующих в фотосинтезе. Другие расположены в стебле и отвечают за транспорт питательных веществ. Третий тип клеток формирует цветки и должен быть яркоокрашенным, чтобы привлекать опылителей. Возможны десятки и даже сотни разных типов клеток, в которых работают разные гены. И это все должно как-то саморегулироваться.

Прежде чем РНК-полимераза сможет начать синтез РНК какого-то гена в эукариотической клетке, с его промотором должно связаться множество белков, которые называются факторами транскрипции. В сущности, бактериальный белок-репрессор, о котором шла речь выше, – это тоже фактор транскрипции, просто у эукариот их много и они работают сообща. Разнообразие факторов транскрипции, способных узнавать разные участки ДНК, у эукариот очень велико. Одни промоторы используют одни факторы транскрипции, а другие – другие. В зависимости от условий, расположения и окружения клетки производят разные факторы транскрипции, поэтому у них работают разные гены, и это очень удобно для генного инженера.

Личинка колорадского жука питается листьями картошки. Есть ген бактерии, кодирующий токсичный для личинки белок. Мы можем перенести этот ген в геном картошки и поместить перед ним универсальный промотор, такой, чтобы он работал во всех клетках растения. Но зачем заставлять картошку тратить энергию и питательные вещества на производство этого белка там, где он не нужен, например в клубнях, которые вредители не едят? Мы можем узнать, какие гены работают исключительно в листьях картошки, и позаимствовать промоторы этих генов. Если поместить под такой промотор ген токсичного для вредителей белка и внедрить эту конструкцию в геном растения, мы добьемся того, что производиться наш белок будет только в листьях, но не в клубнях. Мы получаем гораздо более точный и экономный метод борьбы с вредителями.