Александр Панчин - Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей

Хотя некоторые белки могут вырезать из себя кусок без какой-либо дополнительной помощи 262, инсулин не из их числа. Бактерии не способны вырезать нужный фрагмент из предшественника инсулина. Поэтому, чтобы производить инсулин в бактериях, его ген разрезают на части. Одним бактериям переносят фрагмент гена, кодирующий 21-ю аминокислотную субъединицу инсулина, другим – фрагмент, кодирующий 30-ю аминокислотную субъединицу. Обе субъединицы выделяют, очищают и смешивают вместе, чтобы они связались друг с другом, и в итоге получается инсулин, идентичный инсулину человека.

Скептически настроенный к генной инженерии человек мог бы спросить: если синтаксис жизни столь сложен, если имеется столько подводных камней, то где гарантия, что генетически модифицированный организм будет производить нужный нам белок, а не какую-то ерунду? Заранее дать такой гарантии нельзя, но когда мы уже получили новый сорт или породу организма, мы можем сравнить его белки с белками исходного сорта или породы. Мы можем выделить полученный белок и убедиться в том, что это именно тот белок, который нам нужен, что он был синтезирован правильно и имеет требуемые свойства. Мы также можем проверить, правильно ли встроились сложные генные конструкции с промоторами и операторами и не натворили ли они бед в измененном нами геноме. Хотя методы встраивания генов не всегда точны, мы можем использовать методы чтения ДНК, чтобы понять, какие гены были встроены, в каком количестве и в каком геномном окружении. О том, как читаются генетические последовательности, расскажет следующая глава.

В 1964 году американский биохимик Роберт Холли с коллегами установили последовательность нуклеотидов молекулы транспортной РНК, необходимой для присоединения аминокислоты аланина к синтезирующимся аминокислотным последовательностям белков 263. За это открытие в 1968 году им дали Нобелевскую премию. В 1972-м в лаборатории бельгийского молекулярного биолога Вальтера Фьера впервые в истории была установлена последовательность нуклеотидов белок-кодирующего гена. Это был ген оболочки бактериофага MS2 264, а вскоре стали известны и другие последовательности генов этого вируса 79. В те времена “прочитать" последовательность какого-нибудь гена было все еще настолько серьезным достижением, что, сделав это, можно было смело публиковать статью в престижном научном журнале Nature.

Сегодня прочитанных последовательностей ДНК различных организмов так много, что ученые не всегда успевают их обработать и проанализировать, чтобы хотя бы разобраться, где среди них гены, где регулирующие области, а где всякий ненужный мусор. Забегая немного вперед, скажу, что проект чтения генома человека обошелся в несколько миллиардов долларов и занял более тринадцати лет. С тех пор технология чтения ДНК так сильно подешевела, что при желании любой из нас, обладая средним уровнем дохода, может взять и прочитать своей собственный геном, записать его последовательность на флешку и гордо носить ее на шее. Обойдется это всего в несколько тысяч долларов, но спешить не стоит: в скором времени реализовать такую идею станет еще дешевле. А может быть, в обозримом будущем это и вовсе сделают обязательным требованием для получения медицинской страховки или посещения поликлиники.

Изменилось отношение к чтению ДНК и в научном мире: статья не то что о гене, но даже о полном геноме, содержащем тысячи генов, едва ли произведет большое впечатление и удостоится страниц самых известных научных журналов. Разве что речь пойдет о геноме какого-то совершенно уникального организма, чьи генетические данные радикально меняют представление об эволюции жизни на Земле. Как мы пришли к тому, что читать последовательности ДНК стало так легко?

В 1977 году Уолтер Гилберт и Аллан Максам предложили первый метод чтения ДНК 265. Образец ДНК, содержащий анализируемую последовательность, помещали в четыре пробирки. В каждой из пробирок проводились химические реакции, в ходе которых нуклеотидные последовательности разрезались после разных букв. В первой пробирке молекула ДНК разрезалась после нуклеотидов А или G, во второй – после нуклеотида A, в третьей – после C, а в четвертой – после С или T. В итоге получались фрагменты всевозможной длины. Продукты реакций помещали в четыре параллельные лунки, проделанные внутри специального геля, через который пускали ток.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота, а раз это кислота, значит, в растворе она отдает протон и становится отрицательно заряженной молекулой. Поэтому при включении тока молекулы ДНК начинают бежать от отрицательного плюса к положительному. Маленькие молекулы бегут быстрее, чем длинные, которые застревают в геле, и таким образом нарезанные фрагменты ДНК выстраиваются по длине. Эта процедура упорядочивания молекул ДНК при помощи тока называется гель-электрофорезом.

До помещения в лунки ДНК помечалась радиоактивными метками. После электрофореза на гель накладывалась специальная пленка, которая засвечивалась радиоактивным излучением от меченой ДНК, и ученые получали снимок, где были видны четыре дорожки с чередующимися полосами. Глядя на эти полосы, можно было установить последовательность нуклеотидов анализируемого фрагмента ДНК. Давайте представим, как бы выглядел набор полученных полос для следующей последовательности ДНК: GATTACA.

Самый короткий фрагмент заканчивается нуклеотидом G. Он “убежит" вперед и со временем окажется ближе всех к положительному полюсу. После нуклеотида G разрезание происходило только в первой пробирке, поэтому мы видим одну полосу в крайнем левом ряду. Второй по длине фрагмент заканчивается на нуклеотид А. После этого нуклеотида разрезы происходили в первой и второй пробирках, поэтому мы видим полосы в двух левых рядах. Чтение ДНК по таким снимкам напоминало чтение музыкальных нот с листа, только в этом процессе, как правило, участвовало двое ученых: один, глядя на снимок, называл нуклеотиды, а другой записывал букву за буквой.

К сожалению, мы бы скорее успели колонизировать Марс, чем прочитать геном человека, используя этот метод. Человечество нуждалось в более совершенных методах чтения ДНК. В самой крупной базе данных научных публикаций Web of Science находится более 2,3 миллиона статей, в которых упоминается DNA (ДНК). Среди них на первом месте по количеству цитирований – статья, опубликованная все в том же 1977 году в журнале PNAS британским биохимиком Фредериком Сенгером 266. На эту статью ссылались более 65 тысяч раз! Почти вдвое больше, чем на следующую в рейтинге. Сенгер описал метод “терминации цепи", который произвел настоящую революцию в области чтения ДНК благодаря удобной автоматизации процесса. В основе метода лежат особые “терминирующие нуклеотиды", которые отличаются от обычных тем, что стоит им встроиться в растущую нуклеотидную цепь, и синтез останавливается. Это происходит потому, что у меченых нуклеотидов нет З’-конца, к которому мог бы присоединиться следующий нуклеотид.