Светлана Волкова - Просто геном

К концу 1980-х годов генетический таргетинг уже широко использовался для редактирования ДНК не только в культивируемых клетках мыши и человека, но даже и в самих живых мышах. Основополагающая работа в лаборатории Мартина Эванса продемонстрировала, что таргетинг генов в эмбриональные стволовые клетки мыши и затем введение этих модифицированных клеток обратно в эмбрионы мышей позволяет создавать живых мышей с конструктивными изменениями.

Однако несмотря на потрясающие возможности, которые открылись учёным, обнаружившим, что гены всё-таки возможно видоизменять, в раннюю эпоху генной инженерии первые годы были потрачены на фундаментальные исследования в области редактирования генов, нежели на практическое применение генетического таргетинга в профилактических или лечебных целях. Для генетиков, изучающих гены млекопитающих и пытающихся найти различные пути для лучшего понимания функций генов, генетический таргетинг стал настоящей находкой, технологией, которая сулила выигрыш. Но исследователи в области медицины с огромной осторожностью экспериментировали с генетическим таргетингом на людях, поскольку, несмотря на его эффективность, когда дело доходило до его использования для лечения заболеваний, гомологичная рекомбинация оставляла желать лучшего.

Возможно, самым большим недостатком была проблема негомологичной (незаконной) рекомбинации, где ДНК случайным образом интегрируется в геном, а не поступает в него чётко последовательно. Но учёные выяснили, что на деле незаконная рекомбинация преобладает над гомологичной примерно в 100 раз. Было ясно, что медицинское использование генной терапии с целью лечения в таком случае было бы крайне затруднительным. Учёные разрабатывали элегантные пути, чтобы обойти проблему в клетках, и не теряли надежду на будущее применение новой технологии в медицине. Как отметил Капекки в начале 1990-х годов: «В конечном итоге, гомологичная рекомбинация для генной терапии человека – единственный путь!» Но на то время казалось, что редактирование генов просто недостаточно хорошо изучено для применения с пользой для людей.

В начале 80-х годов, когда многие были заняты размышлениями о генетическом таргетинге в клетках человека, Джек Шостак ломал голову над процессом деления дрожжевых клеток. Профессор Гарвардской медицинской школы решил основательно углубиться в проблему генетического таргетинга и гомологичной рекомбинации. Шостак хотел конкретнее понять, как две нити ДНК из одной хромосомы могут объединяться с двумя совпадающими нитями ДНК из второй хромосомы, обмениваться информацией находясь на промежуточной стадии слияния, а затем снова разделяться, чтобы заново сформировать отдельные хромосомы, после того как клетки разделятся.

В 1983 году Шостак решил, что нашел ответ. Основываясь на результатах генетических экспериментов с дрожжами, он и аспирант Терри Орр-Уивер вместе с профессорами Родни Ротштейном и Фрэнклином Сталем опубликовали провокационную модель, в которой рассматривали путь репарации двуцепочечных разрывов и которая толковала многие интересующие учёных детали об обмене генетической информацией. К 1986 году Шостак уже переключил свои исследования на роль молекул РНК в ранней эволюции жизни. Но в исследовательских кругах и лабораториях всё ещё активно обсуждалась модель, представленная Шостаком, – модель двуцепочных разрывов, о которой звучали как положительные мнения, так и откровенный скептицизм научного сообщества. Но со временем стало ясно, что эта модель разработана на основе обширных экспериментальных данных. Механизм репарации двухцепочечных разрывов имел смысл не только для гомологичной рекомбинации, которая происходила во время образования яйцеклеток и сперматозоидов, но также и для рекомбинации, которая происходила всякий раз, когда ДНК была повреждена.

Все клетки подвергаются воздействию ДНК-повреждающих агентов, таких как рентгеновское излучение и канцерогены, но клетки чрезвычайно эффективны в восстановлении этих разрывов без потери генетической информации. Согласно модели Шостака этот процесс восстановления зависел от способности хромосом к гомологичной рекомбинации. Получалось, что любое повреждение одной хромосомы можно было исправить, просто скопировав соответствующую последовательность на вторую хромосому.

В случае, если модель двуцепочечных разрывов была верной, а выводы, сделанные из исследований дрожжей актуальны и для млекопитающих, то существовала очевидная возможность повысить эффективность редактирования генов: разрезать геном именно в том месте, где нужно внести в него изменения. Если учёным нужно было заменить дефектный ген в геноме созданной в лаборатории исправленной копией, то сначала им требовалось выяснить, как разрезать дефектный ген на части, с локальным двухцепочечным разрывом ДНК, и затем внедрить исправленную копию гена. Столкнувшись с разрывом, клетка попыталась бы восстановить повреждение путем поиска подходящей хромосомы для копирования – и в этот момент она нашла бы синтетический ген, созданный учёными. По сути, учёные таким образом просто-напросто обманули бы клетку, заставив её «думать», что она была повреждена естественным образом, после чего начала репарироваться.

Специалисты лаборатории профессора Марии Ясин, исследователя из онкологического центра имени Слоуна-Кеттеринга, стали первыми играть в эту тонкую игру, решив провести эксперименты на клетках млекопитающих в 1994 году. Остальные учёные с интересом наблюдали за новаторской работой, построенной на модели двухцепочечного разрыва. Эксперимент по редактированию генов в лаборатории Ясин был весьма изобретательным. Ее стратегия заключалась в том, чтобы ввести такой фермент в клетки мыши, который разрезал геном на части, создавая двухцепочечный разрыв; в то же время она добавляла в клетки кусочек синтетической ДНК – шаблон для восстановления – который соответствовал вырезанной последовательности ДНК. Позже она проверяла, восстановили ли клетки мыши поврежденную ДНК, подключив внедрённый шаблон. Проведя один итот же эксперимент с добавленным ферментом и без него, Ясин смогла проверить свою гипотезу: искусственно созданный двухцепочечный разрыв повышает эффективность гомологичной рекомбинации.

Задача заключалась в том, чтобы придумать такой жизнеспособный фермент, который вырезал бы геном в одном конкретном месте из миллиардов возможных. Чтобы решить эту проблему, Ясин ловко украла молекулярный кусочек у дрожжей: эндонуклеазу I-Scel. Нуклеазы – это ферменты, которые расщепляют нуклеиновые кислоты; некоторые разрезают РНК, другие ДНК.