Карин Мёллинг - Вирусы: Скорее друзья, чем враги

Чтобы не допустить производства способных к репликации вирусов, их часто разрезают на части, их гены фрагментируют на 3–4 субвирусные генетические части вместо одной, а затем «упаковывают» в вирусную частицу. Эти части состоят из плазмидной ДНК, и каждая из них может кодировать ограниченный комплект генов. Лентивирусы были созданы для замены более простых ретровирусов. Они являются родственниками ВИЧ. На первый взгляд это кажется устрашающим, но только для читателя и для регуляторных органов. У лентивирусов есть определенные преимущества, поскольку они проявляют активность в неделящихся клетках (в частности, в нейронных клетках). Их можно сделать безопасными. Существуют способы обеспечить такую безопасность путем удаления некоторых генов вирусов или фрагментации и поиска разумных способов предотвратить их превращение в полноценный инфицирующий вирус. На какое-то время эти фрагменты можно соединять и использовать для инфицирования опухолей, и при этом каждая частица поражает одну клетку. Эту систему разработал лауреат Нобелевской премии Дэвид Балтимор из Калифорнийского технологического института (Пасадена).

Студент из Берлина, проходивший летнюю практику в Цюрихе, очень удивил меня вирусом Балтимора. Он просто написал Дэвиду в США и попросил у него терапевтический вирус, а затем без каких-либо проблем привез его в рюкзаке. Я была потрясена! Мы, как полагается, поместили вирус в помещение с надлежащей системой безопасности. Вероятнее всего, наличие на коробке печатного фирменного бланка с моим именем и послужило бесплатным билетом!

Еще одна сложность генной терапии заключается в способе обнаружения вирусом опухолевой клетки в организме. Можно попытаться использовать гиподермическую иглу и ввести суспензию прямо в опухоль или в пространство вокруг нее. Такой способ оказывается эффективным лишь в отношении некоторых опухолей. Мы вводили терапевтические плазмидные ДНК в злокачественные меланомы, которые формируют локальные кожные опухоли. Побочные действия такой терапии для пациентов оказываются менее выраженными, а локальная доза выше системной дозы, которая, попав в кровь, перемещалась бы по всему организму. Однако данная терапия бесполезна против генерализированных метастазов, которые мигрируют в удаленное местоположение. Можно попытаться направить вирус на какую-нибудь дистантную опухоль или метастатическую клетку, используя поверхностные маркеры, своего рода молекулярный адрес. Это принцип идентичен принципу, созданному природой для направления вируса на соответствующую клетку-мишень. ВИЧ распознает свою клетку-мишень по рецептору, находящемуся на поверхности лимфоцитов, для чего задействуется поверхностный гликопротеин вируса gp120, лиганд рецептора – очень ограниченный входной билет для вируса.

Разрабатываются альтернативные подходы. Один из них заключается в изоляции опухолевых клеток, лечении их вне организма, получении в лабораторных условиях большего количества излеченных и подвергнутых соответствующей обработке клеток и последующем их возвращении в организм пациента. Такой метод ex vivo является более безопасным и эффективным, чем терапия invivo.

Интеграция любого ретровируса всегда опасна, поскольку сайты интеграции возникают произвольно, а их модификация может нанести ущерб или повредить клеточные гены. Это явление называется «инсерционный мутагенез» или «инсерция промотора» (имеется в виду сильный вирусный промотор), что может привести к развитию рака. Таким образом, лекарственные препараты могут вызвать рак. Именно это наблюдалось у некоторых детей с иммунодефицитом. Алан Фишер из Парижа лечил 18 детей, используя ретровирусный вектор, который экспрессировал фактор роста для терапии наследуемого иммунодефицита, «аденозиндезаминазной недостаточности». Из-за этого дефицита пациенты становятся настолько восприимчивыми к инфекции, что вынуждены жить в стерильных условиях. Применение генной терапии привело к излечению 16 пациентов, но вместе с тем и к развитию опасного инсерционного (вставочного) мутагенеза у оставшихся двух пациентов, причем вирусный промотор индуцировал у детей лейкемию (к счастью, это состояние можно контролировать). Таким образом, генная терапия ex vivoсопряжена с определенным риском.

Еще одним шагом вперед является разработка индуцируемых ретровирусных векторов. Их по желанию можно включать и выключать путем добавления или удаления регуляторных соединений (например, антибиотика тетрациклина). Таким образом можно повлиять на активность вируса или даже контролировать дозу продуктов, содержащих терапевтические гены. Это может снизить токсичность и прочие побочные эффекты. Некоторые рекомбинантные вирусы после выполнения своих функций самоуничтожаются за счет так называемого процесса «самоинактивации» (SIN).

Существуют индуцированные интерфероном гены, которые мой коллега Йован Павлович (студент Джина Линденманна, ученого, открывшего интерферон) разработал в Институте медицинской вирусологии (Цюрих). Это стало предметом интенсивных исследований Фонда Volkswagen, проводимых на модели выводимых трансгенных мышей. У этих мышей с помощью интерферона можно включать и выключать гены. Для разведения таких мышей требуется около трех лет, и для моих коллег это было не очень привлекательно. Между тем разработан новый и высокоэффективный способ – CRISP/Cas9. В настоящее время выращивание таких мышей – дело нескольких недель.

Понимание механизма формирования опухоли до сих пор остается исследовательским проектом, особенно что касается модели трансгенных мышей. Остается открытым вопрос, как онкогенные белки Ras и Myc комбинаторно индуцируют развитие опухоли? В 2015 г. этот вопрос все еще оставался без ответа, несмотря на то, что уже более 30 лет известно, что тандем этих двух онкогенов является выраженным «возбудителем» рака. Это крайне удивительно. У мышей два этих сильных онкогена не обязательно вызывают развитие рака, и никто не знает, почему так происходит. Каких факторов не хватает? Это ставит под сомнение использование мышей в качестве животной модели для изучения опухолей.

Для использования в целях генной терапии помимо ретровирусов разрабатываются аденовирусы. Их преимущество заключается в способности инфицировать большое число разных типов клеток-хозяев и не интегрироваться, что обусловливает отсутствие генотоксического побочного эффекта. Их можно выращивать до высоких концентраций – 10 11 вирусов на 1 мл, для достижения более выраженного терапевтического эффекта. В 1999 г. в Филадельфии, в начале эры использования генной терапии молодому пациенту с нетерминальной стадией заболевания проводили генную терапию с использованием аденовирусов. Врачи назначили ему до 10 15 вирусных частиц в надежде, что чем выше доза, тем лучше окажется результат. Но произошло обратное: мальчик Джесс Гельсингер умер от избыточной реакции иммунной системы, так называемого «цитокинового шторма», поскольку у него уже выработались собственные антитела против терапевтического вируса. Вся область генной терапии испытала потрясение, а ведущий исследователь был отстранен от обязанностей. Исследователи извлекли из этого случая следующий урок: лечение терапевтическими вирусами следует назначать пациентам, ранее не получавшим соответствующие препараты, то есть не имеющим антител к таким вирусам.