Карин Мёллинг - Вирусы: Скорее друзья, чем враги

В 1999 г. мы с бесчисленным числом соавторов опубликовали в Nature Biotechnology результаты наших исследований онкосупрессоров, которые организуют рецепторы мембраны. Один из них уехал из Цюриха домой в Австралию и добавил в список авторов еще несколько имен. Когда я выразила недовольство по этому поводу, руководитель института, в котором работал вышеупомянутый исследователь, заявил, что хотел бы пополнить этот список еще несколькими именами и счел бы это «честью» для своего университета. Мы включили в список всех этих людей, а потом еще пять человек. Я никого из них не знаю даже сейчас. До того, как этот вопрос разрешился, я получила письмо от одного адвоката, живущего на Гавайских островах. Его клиент – мой бывший студент, который в ожидании визы в США работал у меня в лаборатории, – тоже претендовал на соавторство. Он несколько лет не давал о себе знать. Как он мог узнать о том, что мы готовим статью? Это осталось для меня загадкой, и я предпочла не искать на нее ответ. Я просто включила его имя в список авторов.

Онкосупрессор PDZ связывается с канцерогенным белком Src. Если на его конце отсутствует одна аминокислота, супрессорный эффект PDZ прекращается, теряются межклеточные контакты и у клетки образуются похожие на ножки псевдоподии, с помощью которых она перемещается, становясь метастазом. Совместно со специалистами группы по секвенированию Института молекулярной генетики Общества Макса Планка мы попытались найти различия между метастатическими и неметастатическими клетками путем анализа профиля экспрессии генов, то есть анализа целого набора транскриптов или «транскриптом». Мы выявили 600 генов, характеризующихся различной экспрессией. В эту цифру трудно даже поверить. Далее я расскажу о том, как мы это сделали.

Студент факультета биоинформатики в Обществе Макса Планка сидит перед компьютером, не замечая входящих и выходящих из помещения; стол усеян полупустыми упаковками из-под печенья, а под столом – куча пластиковых бутылок. Он сравнивает транскриптомы нормальных и метастатических клеток. Все, что заканчивается на «-ом», содержит все компоненты определенного образца, все мРНК (транскриптомы), все белки (протеомы), все метаболиты (метаболомы), все киназы (киномы) и т.д. В данном случае действует принцип «Исследуем всё сразу». Особенно это относится к компонентам, которые сами по себе совершенно неизвестны и их изучают не отдельно каждый, а все вместе. ( Одному моему другу – он не ученый – не нравится этот раздел, и он мне предложил убрать его. Вы можете это сделать сами. В любом случае принцип понятен, и все же, вероятно, стоит запомнить несколько технических выражений, если пожилому боссу хочется понимать, о чем говорят его молодые студенты.)

Итак, продолжим. Во-первых, есть компьютер с прекрасным названием Illumina, на котором выполняются все эти операции, секвенирование всех РНК после транскрипции в ДНК. Это высокоскоростной компьютер, с помощью которого осуществляется секвенирование и хранение последовательностей. Сегодня такие компьютеры есть в любом институте при каждом университете. Известные гены идентифицировать легко, а секвенирование неизвестных генов нужно проводить в полном объеме, что приводит к образованию миллиардов последовательностей, называемых «секвенирование нового поколения» (СНП), означающему новую версию предыдущих последовательностей. Повторные последовательности получают, чтобы снизить вероятность статистических ошибок; это называется «покрытие» (или охват), поэтому 10 повторений соответствуют 10-кратному покрытию. Для анализа всех генов образца применяется «геномика». Для фрагментации ДНК используется «метод дробовика», а отдельные части сшиваются обратно для последовательного удлинения. В данном случае нужно выучить новые понятия. Затем новые последовательности выстраивают в один ряд, и их сопоставляют с «референсными геномами» для идентификации. Это образец или модель генома, на которой сходятся ученые. Официальный референсный геном человека получают не от какого-то одного человека, это виртуальный геном. Его собрали из ДНК последовательностей более чем 20 доноров, и его состав постоянно обновляется.

Два «нормальных» генома отличаются друг от друга более чем 3 млн нуклеотидов – малыми нуклеотидными морфизмами (МНМ) (их английская аббревиатура SNP произносится как «снип»), точечными мутациями. Невероятное число различий – действительно ли существует так много «нормальных» различий? Различия касаются почти 0,1% каждого генома, но что это значит? Возможно, в этом нет ничего особенного, по крайней мере это сразу же не приводит к заболеванию. Чтобы выяснить, какие именно различия указывают на заболевания, необходимо выполнить большой объем работ. Однажды эти гены определят с помощью персонифицированной медицины – нетривиальная задача. Что это за гены? Мы задались вопросом о различиях между транскриптомами, уровнем экспрессии генов, которая отличается у нормальных и метастатических клеток, и в качестве примера взяли белок Src. Одно значимое различие видно под микроскопом. В то время как нормальные клетки выращивают в трехмерных культурах клеток, в частности ацинозных, шароподобных структурах, «метастатический» белок делает их «текучими» ( в силу действия некоторых расщепляющих протеаз).

Анализ последовательности указывает, что 600 транскриптов экспрессируются по-разному: в метастатических клетках количество транскриптов в 10, 100 и даже 1 млн раз больше, а у некоторых лишь двукратное отличие от нормальных клеток. Двукратная разница зачастую не принимается в расчет и рассматривается как нерелевантная, но я полагаю, что это неправильно. У нас две хромосомы, и если одна отсутствует, клетка находится на полпути к опухоли. Существует компьютерная программа, позволяющая идентифицировать все эти 600 генов, для чего используется база данных генной онтологии (ГО) или аналогичные базы данных. После того как мы исключили из списка все гены, присутствующие и в нормальных контрольных клетках, у нас все еще оставалось 435 генов, которые могут быть типичными для метастазов. Ряд генов влияет на миграцию, адгезию или апоптоз, а 17 являются транскрипционными факторами, которые, в свою очередь, могут «включить» гораздо больше генов. Как же это сложно! Может, некоторые гены более подходящие, чем другие? Существуют ли «основные», управляющие гены? Многие ученые их ищут, и мы тоже.

Еще один «-ом» – метагеном, то есть сумма всех геномов организма. Очень «модный» метагеном – это микробиом – совокупность всех микроорганизмов, которые могут ассоциироваться с человеком и находиться в ЖКТ, на коже и в органах репродуктивной системы. Столь же интересны образцы, взятые из почвы, сточных вод, озер, океанов, экскрементов живых или ископаемых животных, образцов из легких пациентов с кистозным фиброзом. Секвенируют даже образцы пекинского смога (он содержит микроорганизмы), а из реки Ганг берут пробы воды, чтобы понять, является ли вода этой реки действительно священной (в ней содержатся некоторые фаги, уничтожающие бактерии)! Для этого требуются сотни специалистов по биоинформатике и более совершенные компьютеры. Следующим мог бы стать вопрос о «метаболоме» – всех компонентах метаболизма. А затем? Кином всех киназ? Их уже известно 1000 видов. Я изучала одну из них, в связи с чем возникает вопрос: что нам нужнее – совокупность всех киназ, анализ одной специфической киназы или какого-то частного случая? А ответ следующий: нам нужна и та и другая информация.