Владимир Цыркунов - Инфекционные болезни и профилактика внутрибольничных инфекций

Одним из наиболее используемых методов NATT в настоящее время является ПЦР. ПЦР – метод прямого определения специфического участка последовательности ДНК. Процесс ПЦР включает идентификацию специфической последовательности родительской ДНК для амплификации (копирования) с помощью двух коротких праймеров (участков ДНК), которые комплиментарны концевым участкам этой последовательности. Далее происходит удлинение последовательности ДНК за счет имеющихся в реакционной смеси в избытке дезоксинуклеозидтрифосфатов, катализируемое Tag полимеразой. В результате этого процесса образуются так называемые ампликоны-копии обнаруживаемой последовательности ДНК. Детекция ампликонов осуществляется с помощью электрофореза в агарозе. Тест имеет видовую специфичность, сравнимую с культурой клеток и имеет чувствительность 10 молекул ДНК возбудителя.

ПЦР-анализ позволяет определить содержание (количество копий, титры) ДНК и РНК, провести генотипироваиие возбудителей, определить чувствительность к антибиотикам, прогнозировать исход болезни.

По сравнению с иммунологическими тестами, ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ: высокой и регулируемой специфичностью, задаваемой лишь нуклеотидной последовательностью применяемых праймеров; высокой чувствительностью, позволяющей выявлять не только острые, но и латентные инфекции (применение ПЦР-технологии позволяет диагностировать присутствие даже единичных клеток бактерий).

Структура ответа.Бактериоскопия, вирусоскопия, паразитоскопия материала. Правила забора материала для исследований, доставки и оценка данных.

Примером бактериоскопической диагностики может являться микроскопия мазка на дифтерию. Материал берут двумя тампонами, один из которых используют для выделения культуры возбудителя, а другим делают несколько мазков для бактериологического исследования. Мазки окрашивают щелочным раствором метиленового синего по Леффлеру или другими способами. При положительных результатах под микроскопом среди банальной (преимущественно кокковой) микрофлоры зева и носа видны дифтерийные палочки, расположенные под углом друг к другу. Дифтерийные палочки полиморфны, часто утолщены на концах, неравномерно окрашены. На концах палочек имеются зерна волютина (тельца Бабеша-Эрнста), окрашивающиеся темнее, чем остальное тело палочки, что особенно хорошо выявляется при окраске по Нейссеру (тело палочки светло-коричневое, а зерна волютина темно-синие).

При микроскопии мазка дифтерийную палочку следует дифференцировать от ложнодифтерийной (палочка Гофмана), которая характеризуется отсутствием полиморфизма, равномерным окрашиванием (отсутствие зерен волютина), параллельным расположением палочек.

Бактериоскопическое исследование должны проводить опытные специалисты, поскольку в предварительном мазке типичные дифтерийные палочки редко встречаются в достаточном количестве. Кроме бактериоскопии мазка обязательно проводится бактериологическое исследование материала. Цель его – выделить культуру возбудителя и изучить ее свойства с обязательным определением токсигенности.

Обеспечивается специальными методами (метод серебрения) или методиками по условиям электронной микроскопии. Изучаются внешние характеристики, определяется семейство вирусов, но невозможно определить возбудителя точно.

Её примером может служить приготовление мазка и толстой капли крови при малярии. Основной метод лабораторной диагностики малярии – обнаружение эритроцитарных паразитов в толстой капле или мазке крови. В практической работе исследуют преимущественно толстые капли, так как за один и тот же промежуток времени в толстой капле можно просмотреть в 30–50 раз больший объем крови, чем в мазке, а следовательно, и количество плазмодиев в ней больше. Для выявления возбудителей малярии кровь берут при первом же подозрении на эту инфекцию.

Для приготовления толстой капли крови на предметное стекло наносят каплю крови диаметром около 5 мм. Эту каплю размазывают иглой или углом предметного стекла в диск диаметром 10–15 мм. Толщина капли должна быть такой, чтобы сквозь нее можно было читать газетный шрифт. Мазки не должны быть толстыми, поскольку после высыхания они растрескиваются и отстают от стекла.

Приготовленные толстые капли высушивают при комнатной температуре и окрашивают по Романовскому-Гимзе 30–45 мин. В пораженных эритроцитах видны плазмодии малярии с голубой цитоплазмой и ярко-красным ядром. Нахождение плазмодиев малярии в крови больного является неоспоримым доказательством болезни.

Исследование фекалий при диагностике амебиаза предполагает прямую микроскопию (без окраски и фиксации) слизи и гноя в фекалиях сразу после дефекации или не позднее 10–15 минут. Возможно использование специального микроскопа с подогревом предметного столика до температуры 37°С, что создает условия для сохранения подвижности амёб в препарате.

Структура ответа.Забор материала (условия). Методика посева на среды. Результаты оценки исследований.

Забор материала для бактериологических исследований должен осуществляться до начала лечения этиотропными средствами.

Посев крови лучше всего делать в начальном иериоде болезни или в разгаре, сразу после озноба (наиболее выраженная бактериемия). Посев крони производится на жидкие питательные среды – сахарный, сывороточный, желчный бульон и др. Состав среды выбирается в зависимости от биологических особенностей возбудителя предполагаемой у больного инфекции. Чтобы избежать влияния бактерицидных свойств крови, ее необходимо разводить большим количеством среды, примерно в отношении 1:10.

Посевы испражнений производятся мри кишечных инфекциях (брюшной гиф, пара гифы А и В, шигеллёз, сальмонелле», эшерихиозы и др.), а также при возникает подозрении на кишечные инфекции при наличии признаков поражения желудочно-кишечного тракта. Набор испражнений (2 3 г) производится стерильным деревянным шпателем или стеклянной палочкой из судна, горшка, специального лотка, а также непосредственно из прямой кишки с помощью ватных тампонов, металлических петель или через трубку ректоскопа. Нужно стремиться взять слизь, гной, фибрииные пленки, избегая примеси крови в связи с ее бактерицидным действием.