Светлана Завалеева - Цитология и гистология

Особенно бурно развивалась гистология в советские годы в Москве и Ленинграде, где ученые занимались фундаментальными проблемами общей биологии.

При вузах были созданы НИИ и ЦНИЛы морфологии, Институт Мозга и другие. Общепризнанными авторитетами в области гистологии стали кафедры I МОЛМИ и Университета Дружбы народов, которыми руководил В.Г. Елисеев, создавший прекрасную гистологическую школу. Ученики В.Г. Елисеева (Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина, М.Я. Субботин, В.А. Шахламов, А.И. Радостина и др.) сами стали руководителями крупных коллективов и кафедр морфологов. В Ленинграде получили дальнейшее развитие школы Н.Г. Хлопина (С.И. Щелкунов, А.Г. Кнорре, В.П. Михайлов, Б. Винников и др.), А.С. Догеля, А.А. Заварзина (А.А. Заварзин-мл., Д.И. Дейнека и др.), Н.Г. Колосова (В.Н. Швалев, В.Н. Майоров, А.А. Милохин и др.)

В военно-медицинской академии на кафедре гистологии продолжили экспериментальное изучение крови и соединительной ткани, начатые еще А.А. Максимовым направления. В педиатрическом институте всесторонне исследовали эмбриональный гистогенез тканей (А.Г. Кнорре, Л.В. Суворова). В Ленинградском ветеринарном институте с 1948 по 1983 год кафедрой гистологии руководил известный ученый, продолжатель идей школы А.С. Догеля, ученик А.В. Немилова – 3.С. Кацнельсон, внесший большой вклад в изучение проблемы гистогенеза и гистофизиологии надпочечников. В 1959 г. он опубликовал «Руководство к практическим занятиям по гистологии» для ветеринарных вузов, многократно переиздававшееся в стране.

В развитие возрастной, видовой и сравнительной гистологии сельскохозяйственных животных весомый вклад внесли ветеринарные гистологи: В.Я. Суетин, М.3. Атагимов, Г.Ш. Жанчипов, П.А. Ильин, А.Б. Панфилов, А. П. Попов, Л.П. Тельцов, П.М. Торгун и многие другие.

На развитие отечественной гистологии оказывают значительное влияние Оренбургские гистологи медицинской академии: А.А. Стадников, В.С. Полякова, Н.Н. Шевлюк и другие.

Строение, развитие и функции клеток, и органов можно познать, только применяя разнообразные методы исследования. Гистологический анализ включает в себя следующие главные этапы: выбор объекта исследования, подготовку его для изучения под микроскопом (приготовление гистологических препаратов), микроскопирование препаратов (одним или несколькими методами), качественный и количественный анализ микроскопической картины. Объектами исследования могут служить живые или мертвые (фиксированные) клетки, ткани органов или их изображения на экране дисплея.

Методы исследования мертвых (фиксированных) клеток и тканей. Основой методов служит гистологический препарат.

Приготовление гистологического препарата. Гистологический препарат (постоянный) является основным объектом исследования для морфолога и представляет собой срез ткани (от 5 до 60 мкм), заключенный между предметным стеклом (толщиной от 2 до 3 мм) и покровным (от 0,18 до 0,2 мм). Материалом для исследования служат кусочки органов, мазки крови или слизи, отпечатки органа или оболочки мозга, стенка мочевого пузыря, брыжейка и т.п. (тотальные препараты).

Процесс приготовления гистологического препарата состоит из следующих этапов: взятие и фиксирование материала; его уплотнение; приготовление срезов на микротоме; их окрашивание (контрастирование); заключение срезов в бальзам или синтетические смолы.

Взятие и фиксирование материала. Максимальные размеры кусочков составляют 1x1x0,5 см; соотношение объема материала и фиксирующей жидкости должно быть не менее 1:9. Взятый из органа образец ткани погружают в фиксатор – простой 70 – 96 %-й спирт, 10 – 12 %-й формалин, растворы уксусной кислоты, бихромата калия, осмиевой кислоты или сложный (смеси простых фиксирующих жидкостей или солей тяжелых металлов в определенных пропорциях, обеспечивающие рН и молярность, близкие к таковым в организме). Действие фиксаторов проявляется в том, что в тканях и органах, в результате сложных биофизических процессов, происходит необратимая коагуляция белков, жизнедеятельность прекращается, то есть клеточные структуры становятся мертвыми. Они теперь находятся в том функциональном состоянии, в котором их застигла смерть, то есть зафиксированными. Фиксация приводит к некоторому уплотнению и уменьшению объема образца.

Уплотнение образцов ткани. Цель этого этапа – достичь высокой плотности и пластичности материала для того, чтобы приготовить из него тонкие срезы. Применяют уплотняющие среды – парафин, целлоидин, желатин, органические смолы или замораживание. Пропитка парафином продолжается от 1 до 4 ч, целлоидином – до 1 – 3 нед. Кусочек ткани предварительно обезвоживают (проводят через спирты возрастающей концентрации); затем спирт вытесняют промежуточной средой, способной смешиваться со спиртом и одновременно растворять уплотняющее вещество. При использовании парафина промежуточной средой служат циклические углеводороды (бензол, ксилол) или хлороформ. Для того, чтобы избежать перепада температур (парафин плавится при 60 °C) после вытеснения спирта ксилолом, образец выдерживают от 2 до 3 ч в смеси парафина с ксилолом при температуре 38 °C. Из уплотненного парафином образца вырезают блоки, из которых и готовят тонкие срезы, способные пропускать свет (что является необходимым условием для световой микроскопии). Наиболее тонкие срезы (толщиной от 5 до 7 мкм) удается изготовить из материала, залитого в парафин. Из образцов, уплотненных целлоидином, готовят срезы толщиной от 10 до 30 мкм. Срезы получают на санных или ротационных микротомах; для экспресс-диагностики (срезы толщиной от 40 до 60 мкм) – на замораживающем микротоме.

Окрашивание срезов. Срезы окрашивают, чтобы увеличить контрастность различных гистологических структур в препаратах, предназначенных для исследования в световом микроскопе. Разработаны разнообразные методы окраски. В процессе окрашивания происходят сложные химические и физические процессы, поэтому при выборе метода учитывают избирательное сродство структур клетки к определенным красителям с разными физико-химическими свойствами.

Все красители подразделяют на кислые, основные и специальные. Структуры срезов, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называют оксифильными, основными красителями – базофильными окрашивающиеся как теми, так и другими – нейтрофильными. Специальные красители селективно выявляют конкретные структуры, обладающие сродством к ним. Наиболее широко распространен комбинированный метод окраски тканей – гематоксилином и эозином. Гематоксилин (основной краситель) окрашивает ядра клеток в синефиолетовый цвет, а эозин (кислый) – элементы цитоплазмы в розово-желтый. Окрашенные препараты обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %), просветляют в ксилоле или некоторых маслах и затем каждый гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или синтетические смолы. Готовый (постоянный) гистологический препарат можно хранить годами и использовать для микроскопирования.