Светлана Завалеева - Цитология и гистология

Методами иммуноцитохимии можно идентифицировать клетки различных типов и их рецепторы по маркерным признакам, изучать синтетические и секреторные процессы. Методы основаны на обработке срезов (или мазков) специфическими антителами к выявляемому веществу, которое служит антигеном. Антитела маркируют путем конъюгации с флуоресцентными красителями, ферментами, которые затем выявляются цитохимически или электронно-плотными частицами (ферритин).

С помощью количественных гистохимических методов изучают химический состав конкретных структур клетки.

Цитоспектрофотометрия – это метод количественного и качественного изучения веществ по спектру их поглощения в структурах отдельной клетки. С его помощью можно установить суммарное содержание белков или других элементов. В основе метода лежит принцип абсорбционной спектрофотометрии. Например, с помощыо интерферометрии можно оценить сухую массу и концентрацию плотных веществ в живой и фиксированной клетке.

Метод дифференциального центрифугирования основан на применении центрифуг, развивающих скорости от 20000 до 150000 мин и более. При центрифугировании в определенных условиях, например, в сахарозе в зависимости от градиента плотности, удается отделить и осадить различные органеллы клеток: ядра, митохондрии, фракции пиноцитозных и синаптических пузырьков, рибосом и других компонентов, пригодных для гистохимического исследования.

Метод авторадиографии широко применяют для изучения кинетики клеточных популяций, метаболических процессов в клетках, и определения участков синтеза биополимеров с помощью регистрации веществ, меченых изотопами. Для этого в ткань животного или в среду с культивируемыми клетками вводят предшественников какого-либо макромолекулярного соединения (например, аминокислоты, нуклеотиды), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом (например, радиоактивного водорода Н углерода – С 14, серы, фосфора и других). В процессе синтеза белков, гормонов, ферментов или иных веществ в них включается молекула меченого предшественника. Для регистрации места ее включения в темноте на окрашенные обычными методами срезы наносят специальную мелкозернистую фотоэмульсию, после чего срезы проявляют. На участках соприкосновения фотоэмульсии с радиоактивным веществом происходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участки – метки, или треки. Этим методом можно, например, определить время перемещения клеток, меченых Н 3-тимидином в пластах многослойного эпителия, скорость включения меченых аминокислот в белки, синтез йодсодержащих гормонов в щитовидной железе. С помощыо меченого лейцина, радиоактивных предшественников адреналина, норадреналина к серотонина можно определить не только скорость аксонального транспорта от нейронов к клеткам-мишеням, но и установить топографию нервных связей.

Методы исследования живых клеток и тканей. Современная гистология располагает многочисленными и разнообразными методами, с помощыо которых можно всесторонне изучать строение и функцию живых клеток, тканей органов.

Фазовоконтрастная микроскопия. Естественные биологические объекты в силу наличия в них жидкостей, прозрачны, бесцветны и неконтрастны, Их структуры по отношению к проходящему свету характеризуются одинаковой поглощающей способностью. В отличие от обычной световой микроскопии, где клеточные структуры контрастируют с помощыо окрашивания препарата, в фазовоконтрастном микроскопе системы Намарского, контрастирование достигается благодаря использованию специального объектива и конденсора. Последний преобразует фазовые изменения проходящего через объект света в изменение освещенности полученного изображения. Световые волны могут интерферировать, увеличивая или уменьшая амплитуду результирующих волн. Таким образом, разные компоненты клеток становятся различимыми под микроскопом. В фазовоконтрастном микроскопе различия в амплитуде достигаются благодаря использованию двух пучков световых волк; один падает на объект, другой дифрагируют от него. Данный метод используют, в частности, для прижизненного изучения пленочных препаратов, а также культур клеток и тканей.

Для специальных целей применяют темнопольную и поляризационную микроскопию, в основе которых также лежат особенности интерференции световых волн и возможность преобразования фазовых различий, незаметных для человеческого глаза, в амплитудные.

Методы культивирования и трансплантации клеток и тканей. Сложность изучения тканей в организме обусловлена гетерогенностью и полифункциональностью их клеточного состава, наличием различных барьеров (гематотканевого, гематонервного и других), разнообразием межклеточных и межтканевых взаимоотношений. Изолированные клетки или ткани (культуры) оказываются свободными от воздействия окружающих тканей, от нервных, гуморальных и других влияний, таким образом, становится возможным изучать рост, дифференцировку и взаимоотношения клеток в так называемом «чистом виде».

Изучать культуры тканей можно как вне организма (in vitro), так и в составе организма (in vivo). При культивировании in vitro клетки и фрагменты тканей помещают в специальные флаконы, пробирки, чашки Петри или камеры Максимова. Для культивирования используют как эмбриональные, так и взрослые, обновляющиеся ткани: элементы соединительной ткани (фибробласты), хрящевую и мышечную ткани (поперечно полосатые мышечные волокна и гладкие миоциты), клетки эпителиальных тканей (печени, легких, различных желез), нейроциты, нейроглию и другие.

Клетки и ткани нуждаются в определенных условиях для пролиферации, роста и дифференцировки. Подходящим субстратом для прикрепления, или адгезии, клеток могут служить различные искусственные поверхности или покрытия: фибронектин, полилизин, ламинин, особенно часто употребляют коллаген. Подложки наносят на покровные стекла или на дно пластмассовых чашек в качестве субстрата, необходимого для поддержания длительной жизнедеятельности клеточных и тканевых структур. Не менее важную функцию выполняют питательные среды, которые должны обеспечивать клетки питанием, гормональными факторами, а также элементами межклеточного матрикса. Чаще всего в качестве питательных сред используют гидролизат лактальбумина (ГЛА), гидролизат мышечных белков (ГМБ), среду Игла (МЕМ), 199-ю среду, сыворотку крови крупного рогатого скота, телячью сыворотку, мозговой эмбриональный экстракт и другие.

В зависимости от поставленных задач можно получить культуры органотипические или тканевые; диссоциированные; реагрегированные; линейные перевиваемые.