Крейг Вентер - Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии

Однако, как обсуждалось в 5-й главе, качество секвенирования ДНК, необходимое для чтения генетического текста, намного ниже, чем то, что требуется для написания текста, способного поддерживать жизнь. В первом случае нас устраивала точность не более одной ошибки на 10 000 пар оснований. Может показаться, что это очень мало ошибок, но использование этого стандарта означало бы, что у нас было бы около 60 ошибок в геноме M. genitalium и более 300 000 ошибок в человеческом геноме. Ясно, что столь неточные данные вряд ли смогут поддерживать жизнь и явно недостаточны для точного диагноза генных изменений у человека, ассоциированных с той или иной болезнью. Типичный человеческий ген может состоять из тысяч и даже миллионов пар оснований, поэтому данный уровень ошибок может означать множество ошибок секвенирования в одном гене. Чтобы представить, что это значит: всего одна ошибка в гене может вызвать серьезную болезнь, например серповидноклеточную анемию. Иными словами, такой уровень ошибок вряд ли можно считать приемлемым для реконструкции генома и создания живой клетки.

Эти простые факты часто забывают, фантазируя об оживлении вымерших видов по их секвенированным геномам. Журналистские рассуждения, вдохновленные великими достижениями палеогенетики – геномом неандертальца, прочитанным Сванте Паабо {132} 132 Green, Richard E., Johannes Krause, Adrian W. Briggs, Tomislav Maricic, Udo Stenzel, Martin Kircher, Nick Patterson, Heng Li, Weiwei Zhai, Markus Hsi-Yang Fritz, Nancy F. Hansen, Eric Y. Durand, Anna-Sapfo Malaspinas, Jeffrey D. Jensen, Tomas Marques-Bonet, Can Alkan, Kay Prufer, Matthias Meyer, Hernan A. Burbano, Jeffrey M. Good, Rigo Schultz, Ayinuer Aximu-Petri, Anne Butthof, Barbara Hober, Barbara Hoffner, Madlen Siegemund, Antje Weihmann, Chad Nusbaum, Eric S. Lander, Carsten Russ, Nathaniel Novod, Jason Affourtit, Michael Egholm, Christine Verna, Pavao Rudan, Dejana Brajkovic, Zeljko Kucan, Ivan Gušic, Vladimir B. Doronichev, Liubov V. Golovanova, Carles Lalueza-Fox, Marco de la Rasilla, Javier Fortea, Antonio Rosas, Ralf W. Schmitz, Philip L. F. Johnson, Evan E. Eichler, Daniel Falush, Ewan Birney, James C. Mullikin, Montgomery Slatkin, Rasmus Nielsen, Janet Kelso, Michael Lachmann, David Reich, and Svante Paabo. “A Draft Sequence of the Neandertal Genome.” Science, 7 мая 2010, 328 (5979), стр. 710–722. , или секвенированием ДНК шерстистого мамонта в Университете штата Пенсильвания {133} 133 http://mammoth.psu.edu/index.html , всегда сворачивают на возбужденные мечтания о воскрешении видов {134} 134 Church, George, and Ed Regis. Regenesis: How Synthetic Biology Will Reinvent Nature and Ourselves. Basic, New York, 2012, стр. 11. . Я прочел слишком много статей, бодренько обсуждающих восстановление неандертальцев или мамонта с помощью клонирования, хотя сиквенсы ДНК обоих созданий очень фрагментированы, не покрывают всего генома и – в силу глубокой деградированности – гораздо менее точны, чем те, что обычно получают при чтении свежей ДНК.

Тем не менее прочтение неандертальской ДНК было изумительным достижением науки, поведавшим нам многое о нашей собственной эволюции, установив, что скрещивание некоторых предков современных людей с нашими неандертальскими кузенами оставило нам в наследство 3–4 % нашего генома, восходящие к неандертальцам.

Чтобы синтезировать геном M. genitalium , нам требовалось чрезвычайно точное секвенирование ДНК. Проведенное нами секвенирование двух первых геномов в 1995 году опиралось на ранние модели секвенаторов ДНК, и хотя ошибок было меньше, чем одна на десять тысяч пар оснований, мы опасались, что такой точности может быть недостаточно для порождения живой клетки. Нам ничего не оставалось, кроме как пересеквенировать геном M. genitalium , используя новейшие технологии. Новый сиквенс показал, что наша исходная версия имела точность до одной ошибки на тридцать тысяч пар оснований, и когда мы скомбинировали старую и новую версии, то получили менее одной ошибки на сто тысяч пар – примерно с полдюжины на весь геном. И вот с этой новой высокоточной последовательности мы приступили к синтезу генома M. genitalium .

Наш успех с конвертированием цифровой записи генома phi X 174 в реальную ДНК придал нам достаточно уверенности, чтобы приняться за значительно больший геном свободно живущего организма. Умея производить с большой точностью отрезки размером с вирусный геном, мы понимали, что можем надеяться на успех, если сумеем разбить бактериальную хромосому на такие фрагменты и найдем надежный способ сшивания их всех вместе.

Мы нарезали геном микоплазмы на 101 кассету от пяти до семи тысяч пар оснований каждая. Кассеты были вырезаны так, чтобы каждая перекрывалась с соседними на 80–360 пар оснований, так что мы могли их накладывать друг на друга, как конструктор лего. Мы так спроектировали наши кассеты, что последовательности ДНК в зоне перекрываний были комплементарными: если последней буквой в одной кассете была Т, то она стремилась связаться с А в другой. Подобно застежке-молнии, перекрывающиеся участки сцеплялись между собой комплементарными основаниями, образуя спираль.

Наша попытка создать синтетический геном отличалась еще двумя особенностями. Во-первых, геном M. genitalium , как и phi X , кольцеобразный, поэтому мы спроектировали кассету № 101 так, чтобы она перекрывалась с кассетой № 1. Во-вторых, мы хотели, чтобы у нас был безотказный способ отличить наше изделие от природного генома M. genitalium . Чтобы исключить непонимание и двусмысленность, нам нужно было иметь возможность всегда проследить синтетический геном и неопровержимо доказать, что новой синтетической клеткой управляет именно он, а не примесь от исходной клетки или генома.

Мы хотели поставить подпись в новом геноме (как художники подписывают свои работы), чтобы отличать его от природного. И вот, использовав однобуквенные обозначения аминокислот, мы создали последовательности – «водяные знаки», которые читались как «Институт Вентера» и Synthetic Genomics, Inc. , а также фамилии главных участников проекта. Мы использовали разные кодоны для представления каждой из двадцати букв аминокислотного «алфавита» (в нем представлены не все буквы латинского алфавита, поэтому, например, вместо U мы писали V). Мое имя, закодированное подобным образом, выглядит так:

TTAAЦTAГЦTAATГTЦГTГЦAATTГГAГTAГAГAAЦAЦAГAAЦГATTAAЦTAГЦTAA [17] Каждые три нуклеотида в этой записи соответствуют определенной аминокислоте, входящей в состав природных белков. Таких аминокислот всего 20, каждая из них, помимо традиционного химического названия (глицин, аланин и т. д.), обозначается одной из букв латинского алфавита (см. приложение). Этим и воспользовалась группа Вентера, кодируя свои подписи. Если заменить тройки нуклеотидов (кодоны) буквенными обозначениями соответствующих аминокислот, получится надпись LTSNCRAIGVENTERLTSstop. В ее середине (символы 5–15) можно прочесть имя автора – Craig Venter . Символы 1–4 и 16–18 – «тэги», обозначающие начало и конец «водяного знака». Последнему кодону TAA не соответствует никакая аминокислота – это стоп-кодон, знак окончания считывания. .

Эти «водяные знаки» были вставлены в пять разных кассет, разнесенных по геному. Нам также нужно было вставить ген устойчивости к антибиотику, что позволило бы нам избирательно убивать клетки, в которых нет нашего синтетического генома, и таким образом отбирать те, где он есть. Мы вставили ген устойчивости к антибиотикам внутрь ключевого гена M. genitalium – MG408 , который нужен этой бактерии, чтобы прилипать к клеткам млекопитающих. Тем самым мы надежно искалечили этот ген, играющий важную роль в способности микроба вызывать болезнь, гарантировав, что синтетический организм будет безвредным.