Крейг Вентер - Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии

Чтобы наша команда могла сосредоточиться на ключевом этапе – сборке 101 кассеты в геном, – я настоял, чтобы мы предложили трем компаниям, занимающимся синтезом ДНК, контракт на изготовление для нас 101 спроектированной кассеты. Несмотря на рекламные объявления, мы нашли только одну компанию, которая могла делать фрагменты в пять – семь тысяч пар оснований. Кроме того, это было дорого: синтез ДНК стоит примерно 1 доллар за каждую пару оснований, так что один сырой материал для нас должен был стоить больше полумиллиона долларов. Принимая на себя такое серьезное финансовое обязательство, мы были полны решимости заставить наших контрагентов работать.

Одной из главных трудностей было – как соединить 101 кассету. Первая идея пришла из наших прежних проектов по синтезу геномов. В результате наших попыток охватить как можно более широкое биологическое разнообразие я узнал о весьма примечательном организме, который мог восстанавливать свой геном после значительных радиационных повреждений. В 1999 году мы опубликовали статью «Полное секвенирование генома устойчивой к радиации бактерии Deinococcus radiodurans R1» {135} 135 White, O., J. A. Eisen, J. F. Heidelberg, E. K. Hickey, J. D. Peterson, R. J. Dodson, D. H. Haft, M. L. Gwinn, W. C. Nelson, D. L. Richardson, K. S. Moffat, H. Qin, L. Jiang, W. Pamphile, M. Crosby, M. Shen, J. J. Vamathevan, P. Lam, L. McDonald, T. Utterback, C. Zalewski, K. S. Makarova, L. Aravind, M. J. Daly, K. W. Minton, R. D. Fleischmann, K. A. Ketchum, K. E. Nelson, S. Salzberg, H. O. Smith, J. C. Venter, C. M. Fraser, “Complete Genome Sequencing of the Radioresistant Bacterium, Deinococcus radiodurans R1.” Science , 19 ноября 1999, 286 (5444), стр. 1571–1577. , в которой был описан геном необычного организма, способного выдержать до трех миллионов рад ионизирующей радиации. Если учесть, что смертельная доза такой радиации для человека – всего пятьсот рад, то как может Deinococcus переживать такую атаку? И нельзя ли приспособить те же механизмы репарации ДНК для построения синтетического генома?

Действие радиации на белки и ДНК всех видов примерно одинаково и отчасти связано с размером молекул. В начале своей научной карьеры я посвятил некоторое время определению размеров белков, инактивируя их радиацией. Методика в принципе проста. В белках радиация разрывает пептидные связи, которые соединяют составляющие белок аминокислоты; одного попадания в молекулу белка достаточно, чтобы лишить ее активности. Существует обратная зависимость между размером молекулы белка и дозой радиации, нужной для его инактивации путем разрыва пептидных связей (шанс попасть в крупную мишень гораздо выше, чем в мелкую), поэтому чем меньше белок, тем большая доза радиации нужна. Я использовал этот метод для определения размера белков-рецепторов нейромедиаторов и их функциональных комплексов {136} 136 Venter, J. C., and C. Yung, eds. Target-Size Analysis of Membrane Proteins . Alan R. Liss, New York, 1987. .

Сходным образом радиация поражает и ДНК, разрывая химические связи, соединяющие нуклеотиды между собой. Как и в случае с белками, чем больше геном, тем ниже доза радиации, способная причинить разрушения. Из-за нашего большого генома люди намного чувствительнее к воздействию радиации, чем бактерии. Геном человеческой клетки в тысячу раз больше генома микроба: шесть миллиардов пар оснований против 1–8 миллионов пар у бактерий. Вследствие этого, чтобы разорвать обе цепочки в нашей ДНК, нужна значительно меньшая доза радиации, чем для бактериальной хромосомы. Поэтому мы можем быть уверены, что если нас угораздит попасть под ядерный армагеддон, то мелкие формы жизни его выдержат.

Так как выживает Deinococcus ? Подвергаясь миллионам рад радиации, геном Deinococcus разбивается на сотни двухцепочечных обломков ДНК, но эти бактерии могут чинить и заново собирать свои хромосомы и продолжать реплицироваться. Его способность проделывать такое до сих пор полностью не понята, но в нее входят, в частности, множество копий каждой хромосомы, так что, когда его ДНК оказывается разорвана радиацией во множестве случайных мест, получившиеся фрагменты могут сами выстраиваться в нужном порядке, образуя матрицу ДНК. Я часто уподоблял этот процесс тому, который мы использовали в секвенировании дроблением, когда программа на мощном компьютере заново собирает секвенированные перекрывающиеся фрагменты ДНК, восстанавливая геном.

Мы рассудили, что если бы нам удалось воспроизвести процессы починки ДНК и сборки хромосом вне клеток Deinococcus , то мы могли бы использовать это для сборки нашей синтетической хромосомы из больших, размером с вирусный геном, сегментов ДНК. Двое наших сотрудников, Санджай Ваши и Рэйюань Чуан (Sanjay Vashee и Ray-Yuan Chuang), согласились заняться этой работой. Они перебрали весь геном Deinococcus в поисках всех генов, которые могли иметь отношение к делу, затем провели еще два года, клонируя каждый ген, чтобы получать «ремонтные» белки в лаборатории, где их можно было комбинировать так и сяк для повторения сборки и ремонта ДНК. После тяжких трудов мы были вынуждены сдаться. Мы уперлись в тупик и нуждались в новой стратегии.

Следующим подходом было разработать логичный пошаговый план сборки. Применяя специально предусмотренные перекрывания в последовательностях ДНК соседних кассет, мы собрали «в пробирке» две кассеты, чтобы получить фрагмент побольше. Затем мы клонировали этот более крупный фрагмент в E. coli , чтобы при ее размножении множились бы и копии крупного фрагмента. Таким путем мы могли получить достаточно много ДНК для следующего этапа сборки. Нашей конечной целью было не только получить геном M. genitalium , но и разработать продуктивный воспроизводимый процесс сборки, который мы в дальнейшем могли бы приложить к созданию любых синтетических геномов.

Наш план первого раунда сборки генома состоял в соединении четырех кассет, каждая размером примерно с геном phi X 174 , чтобы создать кусок в 24 000 пар оснований. Для этого мы внесли равные количества каждой из четырех кассет в микроцентрифужную пробирку с векторной ДНК, позволявшей размножить этот свежесобранный сегмент в E. coli . Вектор, который мы использовали, называется искусственной бактериальной хромосомой (ИБХ). В ней один конец перекрывается с началом кассеты № 1, а другой – с концом кассеты № 4.

Чтобы связать куски вместе, мы добавили в смесь ДНК в пробирке фермент (3’-экзонуклеазу), который откусывает по нуклеотиду с конца ДНК, укорачивая лишь одну из двух цепочек ДНК (так называемую 3’-цепочку – это название связано с тем, как нумеруются атомы углерода в сахарах нуклеотидов ДНК) и оставляя другую цепочку (5’-цепочку) открытой. Управляя экзонуклеазой путем изменений температуры, мы могли гарантировать, что соответствующие одноцепочечные концы кассет найдут друг друга и слипнутся за счет химического притяжения комплементарных оснований на каждой цепочке, а-ля Уотсон и Крик.