Крейг Вентер - Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии

Казалось, что шансы невелики, но мы решили провести такой эксперимент. Однако сначала мы должны были ответить на некоторые ключевые вопросы и разработать способ изоляции хромосомы и манипулирования ею без повреждения ДНК. Чтобы защитить ДНК, мы решили изолировать хромосому в маленьких (100 микролитров) блоках агарозы, по консистенции похожих на желатин. Для начала мы поместили бактериальные клетки в жидкую агарозную смесь и вылили ее в формы, которые, охладившись на льду, застыли в маленькие пробки. К плотно упакованным бактериям мы могли добавить ферменты, чтобы вскрыть клетки, содержимое которых, включая хромосомы, вытекло бы в эти пробки. ДНК мы отделяли, промывая пробки протеазой, расщепляющей все белки и оставляющей невредимой ДНК. Потом мы поместили пробки с ДНК поверх геля в установке для электрофореза и включили электрическое поле, чтобы втянуть ДНК в гель. Из-за входящих в ее каркас фосфатных групп ДНК заряжена отрицательно и в электрическом поле будет двигаться в сторону положительного электрода. Варьируя перепад напряжения и плотность геля и применяя разные красители, мы могли установить размер хромосомы, долю белковой примеси, а если ДНК повреждена или порвана – то сделать из нее линейные молекулы, так как линейная ДНК движется через гель быстрее, чем кольцеобразная, а та, в свою очередь, – быстрее, чем сверхспирализованная {150} 150 ДНК может быть в сверхспиральном состоянии, только если она совершенно целая. Любые порезы или нехватки заставляют ее разворачиваться. .

Поэкспериментировав с высвобождением и электрофорезом геномов, мы обрели уверенность, что у нас есть способ изолировать хромосомы, определять, свободны ли они от белков (нам надо было знать, нужны ли какие-то белки для трансплантации), и оценивать, в каком они виде – двухцепочечные, кольцевые или сверхспирализованные. У прокариот и эукариот ДНК по-разному упаковывается, чтобы компактно размещаться в клетках или внутриклеточных структурах. В человеческих клетках ДНК намотана на белки, называемые гистонами, а у бактерий то же самое достигается сверхспирализацией, что, как подсказывает название, означает сворачивание спиралей в спирали. Большинство бактериальных геномов «отрицательно сверхспирализованы», то есть ДНК скручена в направлении, противоположном направлению закручивания двойной спирали. Некоторые предварительные эксперименты подсказали нам, что конформация ДНК имеет значение – в этих суперскрученных хромосомах она лучше всего подходит для пересадки.

Кароль Лартиг и ее команда испробовали много подходов и наконец остановились на процедуре, которая, хотя и была сложной, в итоге сработала. Мы узнали, что освобожденная от белков ДНК может быть успешно пересажена в клетки M. capricolum . Мы также обнаружили, что трансплантации помогают небольшие изменения в клетках-реципиентах. Например, выращивание клеток при pH 6,2 вместо 7,4 резко меняет форму клеток M. capricolum : обычно они яйцевидные, а при таком рН делаются длинными и тонкими. Эта стройность также делает их более проницаемыми – в основном за счет размягчения клеточной мембраны. Чтобы помочь новому геному попасть в клетки M. capricolum , мы использовали также химикат полиэтиленгликоль (ПЭГ), который не только делает мембрану более проницаемой, но и защищает ДНК при ее прохождении сквозь мембрану.

Мы обнаружили, что чистота, тип и источник ПЭГ были ключевыми факторами для успешной трансплантации. Открытие этого простого факта потребовало много нудной, повторяющейся и разочаровывающей работы, да еще с крайним вниманием к мелочам. Когда вы разрабатываете новую технологию, у вас нет рецептов, чтобы их списать, учебников, в которые можно заглянуть, или руководств, чтобы почитать и перенять те мелкие намеки и секреты, которые гарантируют успех. В конце концов вам приходится попробовать все и каждое сочетание условий и ингредиентов. Вы никогда не уверены, какой из многих факторов действительно имеет значение, как они работают друг с другом и друг против друга и так далее. Чтобы разобраться со всеми этими переменными, требуются тщательно продуманные попытки. Это главная часть экспериментальной работы, самая тяжкая и, если вы добились успеха, самая лучшая. На каждый эксперимент, который сработал, вероятно, были сотни проваленных. Проработка деталей в течение многих месяцев тяжелого труда, чтобы трансплантация генома могла превратиться из идеи в реальную, детализированную, действующую процедуру, была огромной заслугой Кароль Лартиг и ее команды.

Чтобы увеличить наши шансы на успех, мы перед трансплантацией добавили к геному M. mycoides две генные кассеты. Одна кассета была предназначена для отбора антибиотиком: когда мы добавим в культуру антибиотик, выживут только клетки, несущие этот защитный набор генов. Кроме того, чтобы воочию увидеть все клетки, в которых трансплантация генома прошла удачно, мы включили туда ген lacZ , кодирующий белок, который в присутствии химиката, именуемого X - gal , сделает клетки-реципиенты ярко-голубыми. Теперь мы знали, как будет выглядеть успех: голубые устойчивые к антибиотику колонии. Однако мы должны были быть уверены, что это именно то, чего мы хотим: синева могла означать и то, что lacZ и гены устойчивости к антибиотику перенесены в геном M. capricolum .

К несчастью, это не осталось лишь теоретической возможностью. Мы много раз пытались трансплантировать геном M. genitalium в клетки M. genitalium , и хотя мы часто получали голубые клетки, мы обнаруживали, что это всегда было из-за простой рекомбинации – lacZ и гены устойчивости действительно оказывались перенесены из почти идентичного пересаженного генома M. genitalium в геном клетки-реципиента M. genitalium .

Пересаженный геном был просто слишком близок по структуре последовательности к геному клетки-реципиента, поэтому их составные части могли смешиваться. Мы на горьком опыте научились не слишком возбуждаться при виде голубой колонии, пока успех не подтвержден должным образом.

Пересадив геном M. mycoides в клетки M. capricolum , наша команда в очередной раз добилась видимого успеха, опять получив голубые клетки. Вырастив одну голубую колонию, мы чистили и перепроверяли ее и, неделя за неделей, месяц за месяцем наращивали количество, пока в нашем распоряжении не оказались десятки колоний. Умудренные опытом, мы теперь придумали несколько экспериментов, чтобы проанализировать голубые клетки, получившиеся при трансплантации генома.

Наш первый анализ использовал ПЦР для амплификации последовательностей, которые, как мы знали, есть только в геноме M. mycoides . Таким же образом у нас было несколько последовательностей, которые встречаются только в геноме M. capricolum , и мы пытались их амплифицировать из голубых клеток. Мы начали ликовать только тогда, когда смогли обнаружить амплифицированные последовательности из пересаженного генома и ни одной – из клетки-реципиента. Небольшой шанс, что мы видим результаты рекомбинации геномов, все еще оставался, но по мере изучения новых и новых последовательностей эта вероятность все уменьшалась. Мы провели дополнительный электрофорез ДНК пересаженных клеток, который показал только фрагменты генома M. mycoides и ничего из генома M. capricolum .