Крейг Вентер - Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии

Чтобы проверить геном M. mycoides , пропущенный через дрожжи, мы пересадили его, как раньше, в клетки M. capricolum . Однако проделав этот эксперимент много раз, команда не смогла получить никаких измененных клеток. Они провели контрольные опыты, используя геном, выделенный непосредственно из клеток M. mycoides дикого типа, и его удалось успешно трансплантировать, как и раньше. Я ждал результатов, и ко мне пришел Хэм Смит с обескураживающим вердиктом: «Геномные транспланты из дрожжей не работают». Видимо, источником проблемы были дрожжи, которые позволяли нам манипулировать длинными кусками бактериальной ДНК.

Мы с Хэмом Смитом уже обсуждали, что может отличаться в геноме M. mycoides , выращенном в клетках M. mycoides , от такого же генома, выращенного в дрожжевых клетках, поэтому во время видеоконференции между роквильской командой и группой в Ла-Хойе мы быстро сфокусировались на самой очевидной разнице. В клетках M. mycoides ДНК специфически метилируется (украшается молекулярными довесками, называющимися метильными группами). Эти группы, производные метана, состоят из одного атома углерода и трех атомов водорода (CH 3). Бактериальные клетки используют метилирование ДНК для защиты ее от нарезки собственными рестриктазами – добавляя метильные группы к тем основаниям ДНК, которые рестриктаза распознает. У дрожжей, однако, нету таких же рестриктаз и системы метилирования ДНК, а бактериальные метилазы вряд ли синтезируются в дрожжах из-за некоторых различий в генетическом коде. Мы подумали, что если геном M. mycoides в дрожжах действительно не метилируется, то при пересадке его в M. capricolum рестриктазы клеток-хозяев должны немедленно его разрушать.

Мы испробовали два подхода для проверки идеи, что причиной неудач трансплантации была неметилированность ДНК в дрожжах. В первый раз мы клонировали шесть генов, обеспечивающих метилирование ДНК у M. mycoides , чтобы получить ферменты, которые метилировали бы геном M. mycoides после выделения его из дрожжевых клеток. Этот метод оказался успешным: геном, выделенный из дрожжевых клеток, метилированный и пересаженный в бактериальные клетки, наконец заработал. Если бы мы метилировали геном M. mycoides экстрактом клеток M. mycoides или клонированными и очищенными ДНК-метилазами, то мы могли бы так же успешно пересадить их в клетки M. capricolum. Как окончательное доказательство того, что метилирование ДНК было решающим фактором, мы удалили из генома реципиента M. capricolum ген рестриктазы, рассудив, что если у клетки-реципиента нет рестриктаз, то мы сможем пересадить голую ДНК M. mycoides из дрожжей напрямую, без необходимости в защитном метилировании. В этом и было все дело, и вот теперь наконец-то мы вроде бы собрали все нужные компоненты для трансплантации синтетических хромосом.

Это краткое описание не отражает того, что решение проблемы метилирования на самом деле потребовало более двух лет тяжелого труда, но зато по ходу дела мы разработали очень мощный новый набор инструментов, который дал нам такие возможность манипулировать бактериальными хромосомами, каких не было никогда раньше. Большинство бактериальных клеток не имеет таких генетических систем, как гомологичная рекомбинация, имеющихся у дрожжей и E. coli . В результате внести серьезные генетические изменения в большинство бактериальных геномов очень трудно, если не невозможно. Это одна из причин, по которой большинство ученых работает с E. coli : они делают это просто потому, что с ней можно работать.

Однако теперь, добавив эукариотный (дрожжевой) центромер к прокариотному (бактериальному) геному, мы могли выращивать бактериальный геном в дрожжах, где он вел себя как одна из хромосом дрожжей. Это проложило путь к использованию дрожжевой системы гомологичной рекомбинации для проделывания многих и быстрых изменений в геноме. А потом мы смогли выделить модифицированный бактериальный геном, метилировать его, если необходимо, и трансплантировать в клетку-реципиент, чтобы создать новую клеточную версию. Это стало огромным прогрессом в генетических манипуляциях. До этого открытия ученые по большей части были ограничены возней с индивидуальными генами. Теперь для нас стало обычным делом оперировать наборами генов и даже целыми геномами. Мы опубликовали результаты в Science в сентябре 2009 года {156} 156 Lartigue, Carole, Sanjay Vashee, Mikkel A. Algire, Ray-Yuan Chuang, Gwynedd A. Benders, Li Ma, Vladimir N. Noskov, Evgeniya A. Denisova, Daniel G. Gibson, Nacyra Assad-Garcia, Nina Alperovich, David W. Thomas, Chuck Merryman, Clyde A. Hutchison, III, Hamilton O. Smith, J. Craig Venter, and John I. Glass. “Creating Bacterial Strains from Genomes That Have Been Cloned and Engineered in Yeast.” Science, 25 сентября 2009, 325 (5948), стр. 1693–1696. Опубликовано онлайн 20 августа 2009. .

К тому времени мы разработали новые способы синтезировать молекулы ДНК в двадцать раз длиннее, чем было возможно ранее; мы разработали методику трансплантации генома из одного вида в другой и создания нового вида; и мы решили проблему модификации ДНК, предотвращающей разрушение ее рестриктазами. Нас и многих из тех ученых, кто следил за нашим продвижением, интересовало, сможем ли мы в итоге преуспеть в создании клетки, основанной на синтетическом геноме. Теперь, когда мы показали, что можем перейти от дрожжей к микоплазме, следующий шаг был перейти от синтетической ДНК в дрожжах к микоплазме. Мы были готовы, скомбинировав все эти новаторские подходы, творить историю. Но ту ли микоплазму мы взяли?

Поскольку мы достигли значительного прогресса в использовании дрожжей для манипуляции большими кусками ДНК, наши команды упорно продолжали свои попытки пересадить синтетический геном M. genitalium , но довольно безуспешно. Выглядело так, будто мы могли превратить более крупный вид M. pneumonia в M. genitalium пересадкой природного генома, но не могли достичь того же результата с синтетической версией. Наконец мы обнаружили, что реципиентные клетки M. pneumonia имеют на своей поверхности какую-то нуклеазу, которая съедает любую подвернувшуюся ей ДНК.

Но нас продолжал терзать чрезвычайно медленный рост клеток M. genitalium , сильно ограничивавший число возможных экспериментов. Для всех нас, а особенно для меня, ждать результатов неделями было не просто тяжело, а прямо-таки физически мучительно. Надо было что-то менять. Занимаясь метилированием ДНК и трансплантацией, мы одновременно придумывали более быстрый способ создания синтетической ДНК, технический прием, который дал бы новые возможности в нашей затее по трансплантации синтетической бактериальной ДНК. Как я уже писал, наши начальные этапы синтеза ДНК требовали нескольких шагов, начиная со сборки коротких олигонуклеотидов в конструкции покрупнее. Однако Дэн Гибсон чрезвычайно упростил этот метод, так что теперь у нас был одноступенчатый процесс.