Крейг Вентер - Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии

Работу нашего биологического отладчика мы решили начать с проверки одиннадцати сегментов по 100 000 пар оснований. Мы сделали сегменты того же размера из природного генома M. mycoides так, чтобы можно было поочередно подставлять вместо каждого из них синтетический сегмент и смотреть, смогут ли они поддерживать жизнь. Из этих сложных экспериментов мы выяснили, что из одиннадцати синтетических сегментов по 100 килобаз все, кроме одного, совместимы с жизнью. Для окончательного доказательства Дэн Гибсон сконструировал гибридный геном с десятью синтетическими сегментами и одним природным и получил успешные трансплантаты.

Установив, который сегмент содержал ошибку или ошибки, несовместимые с жизнью, мы секвенировали ДНК еще раз – теперь высокоточным методом по Сэнгеру – и выяснили, что там выпала одна пара оснований. В таких случаях тривиальное сравнение нуклеотидов с буквами несколько сбивает с толку: кажется, что это так же мало влияет на понимание текста, как, скажем, написание «ошбка» вместо «ошибка». Но дело в том, что текст ДНК читается тройками нуклеотидов, каждой аминокислоте в белке соответствует комбинация из трех оснований – кодон. Это означает, что выпадение одного основания меняет всю дальнейшую генетическую последовательность: разбиение на кодоны в ней будет совсем другим, а значит, другой будет и последовательность аминокислот, которую этот участок ДНК кодирует. Это называется «мутация со сдвигом рамки»; в данном случае сдвиг произошел в важном гене dnaA, который способствует раскручиванию ДНК в начале репликации – без этого ДНК не может удвоиться. Это выпадение одного-единственного основания препятствовало клеточному делению и поэтому делало жизнь невозможной. Когда мы нашли критическую ошибку, мы смогли пересобрать сегмент в 100 кб правильно и использовать дрожжи для пересборки всего генома целиком. Теперь мы опять были готовы к попытке пересадки генома.

Как и раньше, решающий эксперимент был начат в пятницу, чтобы успешные колонии имели достаточно времени для роста и к следующему понедельнику выглядели бы как голубые точки. Дэн Гибсон сообщил нам имейлом о последней попытке:

Крейг, Хэм, Клайд, Джон, полный синтетический геном (с четырьмя водяными знаками и без мутации в dnaA) был трансплантирован сегодня. Геном выглядит потрясающе. Он проанализирован на мультиплексе ПЦР на все 11 соединений и четыре водяных знака. Его также проверили рестриктазами и анализом FIGE [22] FIGE – гель-электрофорез в инвертируемом поле. . Одновременно с ним трансплантировали два клона из дрожжей с полусинтетическими геномами 10/11 [23] То есть геномы из 10 искусственных и одного природного фрагмента. . Эти геномы были проанализированы, как и вышеупомянутый, и тоже выглядят отлично. Я пошлю мейл утром в понедельник, но имейте в виду, что колонии появлялись позже, чем обычно, так что мы можем не получить ответа до вторника.

В пятницу после обеда Дэн вручил маленький флакон своей коллеге Ли Ма, которая сидела под колпаком биозащиты – в одном из закрытых рабочих мест с сепараторным фильтром, которые мы использовали в наших лабораториях для работы в стерильных условиях. Флакон содержал маленький кусочек агарозы, в котором находилось несколько миллионов крохотных кольцевых ДНК – хромосом, каждая из которых содержала наш синтетический геном из 1 078 809 пар оснований. Это была синтетическая ДНК с 886 генами M. mycoides и с нашими «водяными знаками». Ли добавила капли фермента, который должен был растворить гель и оставить синтетические геномы, которые она затем добавила в другой маленький флакон, с реципиентными клетками M. capricolum и полиэтиленгликолем, делающим мембраны проницаемыми для ДНК. Ли распределила клетки на чашке Петри с красным агаром – составом, который будет питать новые клетки сахаром и аминокислотами. В агар был также добавлен тетрациклин, чтобы убить все клетки-реципиенты, которые не примут синтетический геном, и краситель X-gal , от которого новые клетки, содержащие трансплантированный геном, станут ярко-голубыми. Ближе к вечеру Ли поставила чашки Петри в инкубатор, чтобы держать клетки при постоянной температуре 37 градусов. Если новые клетки получились, то им понадобится пара дней, чтобы поделиться нужное число раз для превращения в один миллион дочерних клеток – маленькую колонию, видимую невооруженным глазом.

Все выходные я психовал. Тот миг, когда мы должны были увидеть, успешны ли наши модификации генома, казалось, отъехал в бесконечность. Наконец, очень ранним утром понедельника Дэн Гибсон трясущимися от предвкушения руками открыл дверцу инкубатора и начал по одной вынимать чашки Петри. Оставив лучшее на потом, он начал с контрольных (тех, которые должны были показать, что Ли Ма следовала правильной процедуре) и осматривал каждую на свет, чтобы проверить, видны ли уже колонии. Затем он перешел к тем, что содержали синтетическую ДНК. И там, почти в центре одной чашки, была одна – и только одна – ярко-голубая колония клеток.

Дэн остановился, чтобы оценить значительность момента. Поглядев на чашки Петри несколько минут, он поставил их все обратно в инкубатор и послал мне в четыре утра по Роквиллю простое сообщение: «У нас есть голубой трансплантат». Мы прошли такой долгий путь, потерпели столько неудач, столько лет ушло на пробы и ошибки, на решение проблем и изобретения. Наконец, кажется, усилия окупились.

Пока в Роквилле разыгрывался этот эксперимент, я находился в нашем таунхаусе в Александрии, в Виргинии, так что я был в той же временной зоне, что и Дэн. Мы скоро обменялись серией сообщений. Дэн снова написал: «Пока что появились одна или две голубых колонии с пересаженным полным синтетическим геномом! Еще рано точно подсчитывать количество трансплантатов, но я уверен, что это число возрастет. Мы посмотрим сегодня попозже и сделаем окончательный подсчет завтра». Нам надо было подтвердить, что голубая колония содержит только синтетическую ДНК. Я сказал Дэну, что буду в институте к десяти утра, и спросил, через сколько времени будут результаты первой проверки.

Я прихватил свою видеокамеру и пару бутылок шампанского и направился в Роквилль по мемориальной автостраде Джорджа Вашингтона. Сразу по прибытии я кинулся прямо в лабораторию, где встретил Дэна, сияющего и уже окруженного остальной командой. После нескольких теплых рукопожатий Дэн провел меня к инкубатору и вытащил чашку с культурой, чтобы показать мне первую голубую колонию. Мы сделали несколько снимков ее и осторожно убрали обратно в инкубатор то, что очень походило на первую жизненную форму с полностью синтетическим геномом.

Позже в тот день я получил первое подтверждение, что чашка с культурой содержит синтетический геном: «Поздравляем! Это официально. Вы гордый отец синтетической клетки mycoides !» Я собрал всю команду в актовом зале в Роквилле и передал наше видео остальной команде синтетического генома в Ла-Хойе. (Я удостоверился, что у команды в Ла-Хойе тоже достаточно шампанского на льду.) Хотя окончательная проверка результатов должна была занять еще несколько дней, мы все радостно подняли тост за наш очевидный успех.