Крейг Вентер - Жизнь на скорости света. От двойной спирали к рождению цифровой биологии

Реакции сборки ДНК, которые использовал Дэн для своего нового метода, были очень сходны с теми, которые мы задействовали в нашей предыдущей работе, за исключением того, что он сделал важное открытие: все они могут проходить в одной пробирке и при одной температуре. Дэн сообразил, что экзонуклеазы, укорачивающие одну цепочку ДНК, не конкурируют с ДНК-полимеразой, которую мы использовали, чтобы дополнить ДНК второй цепочкой. Кроме того, когда все ферменты скомбинированы в одной реакционной смеси при 50 ºС, экзонуклеаза при такой температуре быстро инактивируется и поэтому может откусить как раз столько оснований, чтобы позволить фрагментам ДНК сплавиться друг с другом.

Эта работа была огромным прорывом по сравнению с нашим предыдущим подходом, нудным и трудоемким. Сила этой «Гибсоновой сборки», как мы ее назвали, – в ее великой простоте. До нее мы неохотно думали о повторении марафонских усилий, которых потребовало создание нашей первой синтетической хромосомы M. genitalium JCVI-1.0 , из десяти тысяч кусков ДНК, не говоря уж о чем-то побольше. Исходно мы полагали, что самой трудной для решения проблемой будет химия синтеза генома; теперь же развитие технологии синтеза убедило меня в том, что надо существенно поменять направление программы.

Я поговорил с Хэмом Смитом и сказал, что мы неправильно подошли к проблеме. Поскольку мы, видимо, никогда не будем успешно работать – а скорее только мучиться – с медленно растущей M. genitalium , я сказал ему: «Я хочу, чтобы мы остановили все работы на ней и применили наши новые технологии для синтеза генома M. mycoides ». Это было довольно нахальное требование, потому что геном mycoides вдвое больше genitalium . Но к этому времени мы знали, как пересаживать геном M. mycoides из дрожжей и как сделать клетки M. mycoides из клеток M. capricolum ; а вооружившись сборкой Гибсона, мы теоретически могли собрать геном в 1,1 миллиона пар оснований относительно быстро.

Поначалу я столкнулся с сильным сопротивлением своей команды, и задним числом я не удивляюсь, что они приняли в штыки это радикальное предложение – не только начать всё сначала, но еще и нацелиться на более амбициозный объект. Дэн Гибсон, понятное дело, согласился с моим изменением плана, в то время как Хэм Смит и остальная команда хотели двигаться по прежнему пути, со знакомым набором проблем, но сконцентрироваться на поиске путей их разрешения, даже если это значило продолжать мучиться с медленно растущими клетками genitalium . Однако после нескольких раундов обсуждения, давших всем достаточно времени, чтобы обдумать мою идею, мнения стали меняться. Хэм пришел ко мне и сказал, что он согласен, что нам надо сменить направление; мы сразу же позвонили Дэну Гибсону и сказали ему, чтобы он начинал синтезировать геном M. mycoides .

Одной из причин, по которой команда сначала воспротивилась этому новому подходу, было то, что у нас в тот момент не было точной последовательности генома M. mycoides . Мы начали проектирование и синтез с того, что быстренько секвенировали две цепочки. Две наших последовательности генома из изолятов M. mycoides отличались друг от друга в 95 местах. Поскольку дрожжи теперь играли центральную роль в сборке синтетических геномов, мы выбрали последовательность из того изолята, который уже успешно клонировали в дрожжах и пересаживали в клетки-реципиенты.

Мы начали с проектирования 1078 кассет, каждая из которых включала 1080 пар оснований и перекрывалась с соседними на 80 пар.

Чтобы иметь возможность вырезать собранные последовательности из векторов, в которых они росли, мы добавили к кассетам еще одну последовательность на восемь оснований, опознаваемую рестриктазой NotI как место резки. Мы также добавили четыре «водяных знака», чтобы отличать наш синтетический геном от любых естественно возникших разновидностей. «Водяные знаки» занимали от 1081 до 1246 пар оснований; в них специально разработанным кодом были зашифрованы цифры и английские слова. Мы позаботились вставить последовательность «водяных знаков» в те участки генома, где они, как мы показали экспериментально, не повредили бы жизнеспособности клетки. Закончив проектирование, мы заказали 1078 кассет в Blue Heron , одной из первых ДНК-синтезирующих компаний, расположенной в Ботелле, штат Вашингтон. Компания собрала сегменты по 1080 пар оснований из химически синтезированных олигонуклеотидов, секвенировала их, чтобы убедиться, что они отвечают нашим спецификациям, и отправила их нам.

Теперь мы могли начать конструирование синтетического организма всерьез. Мы использовали иерархическое конструирование, которое шло в три этапа. На первом мы с помощью Гибсоновой сборки построили из кассет по 1080 пар оснований серию из 111 более длинных кассет, каждая около 10 тысяч пар оснований. Как всегда, точность была превыше всего, поэтому мы секвенировали все 111 и в девятнадцати нашли ошибки. Эти ошибки последовательностей были исправлены, после чего 10-килобазные клоны были пересобраны и пересеквенированы, чтобы проверить, правильные ли они.

Во втором раунде сборки генома мы собрали перекрывающиеся кассеты по 10 килобаз, чтобы сформировать кассеты по 100 000 пар оснований (которые мы тоже секвенировали, чтобы проверить свою точность). Наконец мы собрали получившиеся одиннадцать кассет по 100 кб вместе в дрожжах, чтобы получить последовательность в 1,1 миллиона пар оснований генома M. mycoides . Нам надо было еще раз проверить, что сборка работает, и мы использовали ПЦР и переваривание рестриктазами, чтобы подтвердить, что геном у нас построен правильно.

Наконец мы были готовы к попытке создания первой синтетической клетки посредством пересадки полного синтетического генома M. mycoides из дрожжей в реципиентные клетки M. capricolum . Как и раньше, успех должны были возвестить голубые клетки. Первая пересадка была проделана в пятницу, и мы напряженно ждали весь уикенд, чтобы посмотреть, не появятся ли к утру понедельника голубые клоны. Но понедельник пришел и прошел, не принеся никаких положительных результатов. Пересадку повторяли в две следующие пятницы, но снова никаких голубых колоний, только хмурые понедельники.

При взгляде назад ясно, что мы были очень близки к успеху, хотя тогда мы этого не чувствовали. После проведения всех контролей мы пришли к выводу, что мимо всех проверок, которые мы делали во время синтеза генома, как-то проскользнула ошибка в замысле или последовательности. Поскольку мы секвенировали ДНК, то предположили, что ошибка должна была быть в одной из исходных последовательностей, которые мы взяли за образец генома. Чтобы проверить наши последовательности, нам надо было создать биологический эквивалент того, что разработчик компьютерных приложений определил бы как отладочную программу. Операционная система современного компьютера обширна, в ней десятки миллионов строк кода {157} 157 Например, у Windows XP примерно 45 миллионов строк кода. http://www.facebook.com/windows/posts/155741344475532 , и в течение десятков лет инженеры разрабатывали умные отладочные программы, чтобы помочь находить ошибки.