Чарльз Эллис - Эпигенетика

Пол Шедл (Paul Schedl) изложил концепцию хромосомных «граничных элементов» (Vazquez et al., 1993). Первые такие элементы были локализованы с той или другой стороны района «пуфа» в локусе теплового шока у Drosophila и определены по необычной структуре их хроматина — устойчивому к нуклеазе кору величиной ~300 п.н., ограниченному гиперчувствительными к нуклеазе сайтами. Постулировали, что такие элементы разделяют домены хроматина вдоль по длине хромосомы. Два теста in vivo свидетельствовали в пользу этой гипотезы: (1) Ограничивая ту или другую сторону репортерного гена, граничные элементы эффективно устраняли хромосомные эффекты положения, когда этот конструкт случайным образом вставлялся в геном. (2) Граничный элемент определялся также по его способности блокировать функцию энхансера. Будучи вставлен между промотором гена и его энхансером, граничный элемент блокировал экспрессию данного гена. Хотя и не в столь определенном виде, эта концепция граничных элементов была разработана и для других организмов, особенно на глобиновом локусе у млекопитающих (Clark et al., 1993).

Исследования на почкующихся дрожжах высветили развивающийся механистический подход [a mechanistic inroad] к связанным с хроматином эпигенетическим явлениям. Было уже установлено, что сайленсеры в «молчащих» локусах типа спаривания являются сайтами для нескольких связывающихся с ДНК белков. Их связывание оказалось зависимым от контекста, примером чего может быть белок Rap1, который не только играет важную роль в сайленсинге, но и связывается «вверх по течению» от ряда генов, активируя транскрипцию (обзор см. Laurenson and Rine, 1992).

На протяжении ряда лет были установлены многочисленные связи между репликацией ДНК и транскрипционно «молчащими» районами генома. Неактивная Х-хромосома, гетерохроматин и «молчащие» импринтированные локусы — все они, как сообщалось, поздно реплицируются в фазе S по сравнению с транскрипционно активными районами генома. Кроме того, было показано, что установление сайленсинга в «молчащих» локусах типа спаривания требует прохождения через фазу S, что заставляет предполагать, что «молчащий» хроматин должен быть построен на недавно реплицированной ДНК. Так, огромный интерес вызывал тот факт, что один из сайленсеров оказался точкой начала репликации ДНК («ориджином»), а его активность в этом качестве нельзя было отделить от функции сайленсинга (Fox et al., 1993). Более того, мутанты в недавно идентифицированном комплексе распознавания «ориджина» (ORC — origin recognition complex) «портили» сайленсинг (Bell et al., 1993; Fox et al., 1993).

Еще один подход к «расчленению» структуры гетерохроматина и ее влияние на экспрессию генов обусловило открытие, показавшее, что теломеры у Saccharomyces cerevisiae приводят в действие PEV, аналогичный наблюдаемому у Drosophila. Репортерные гены, вставленные около теломер, обнаруживают мозаичную экспрессию в колонии дрожжей. Репрессированное состояние зависит от многих генов ( SIR2, SIR3, SIR4) из тех, что необходимы для сайленсинга в «молчащих» локусах типа спаривания. Были описаны несколько ключевых аспектов, касающихся структуры «молчащего» хроматина и регуляции мозаичной экспрессии. Заслуживает упоминания тот факт, что цитологически гетерохроматин определяется как конденсированный хроматин, но «молчащий» хроматин у S. cerevisiae никогда не удавалось визуализировать таким образом. Тем не менее, из-за сходства с PEVу Drosophila «молчащий» хроматин у дрожжей всегда были склонны рассматривать как функциональный эквивалент гетерохроматина (описано в Weintraub, 1993).

На основе исследований на дрожжах начал формироваться ряд фундаментальных концепций. Во-первых, стало очевидным важное значение гистонов H3 и Н4. В частности, аминотерминальный «хвост» гистонов H3 и Н4 оказался непосредственным участником формирования «молчащего» гетерохроматина (Thompson et al., 1993). Специфические мутации в «хвостах» этих гистонов облегчали или портили сайленсинг и позволяли думать, что и общий заряд остатков на «хвостах», и специфические остатки в составе «хвостов» вносят вклад в сайленсинг. Кроме того, на заре использования иммунопреципитации хроматина (ChIP) было продемонстрировано, что лизины в аминотерминальном «хвосте» гистона Н4 гипоацетилированы в районах «молчащего» хроматина по сравнению с остальной частью генома. Более того, одна из гистоновых мутаций позволила идентифицировать H4K16 гистонов (который может быть ацетилирован) как критичный для формирования «молчащего» хроматина

Теломеры оказались простейшей системой для более глубокого понимания того, каким образом белки Sir опосредуют сайленсинг. Была разработана концепция рекрутирования белков сайленсинга. Говоря коротко, оказалось, что белок Rap1, связывающийся с теломерной ДНК, взаимодействует с Sir3 и Sir4 двугибридным способом (by two-hybrid methods — описано в Palladino et al. 1993). Таким образом, Rap1 может «рекрутировать» эти белки Sir к теломерному району генома. Имелись данные о том, что Sir3 и Sir4 могут связываться друг с другом и что (и это особенно важно) Sir3 и, возможно, Sir4 взаимодействуют с «хвостами» гстонов H3 и Н4 (Thompson et al., 1993). Более того, сверхэкспрессия Sir3 заставляет его «распространяться» по хроматиновой фибрилле внутрь от теломеры, позволяя предполагать, что он является лимитирующим компонентом «молчащего» хроматина и может «полимеризоваться» вдоль хроматина (Renauld et al., 1993). Все вместе показывало, что существует, оказывается, обширная сеть взаимодействий, важная для сайленсинга, — белки Sir инициируют сборку на теломерной ДНК, благодаря их взаимодействию с Rap1, а затем полимеризуются от теломеры вдоль хроматинового волокна, предположительно связываясь с «хвостами» гистонов H3 и Н4.

Переключение между транскрипционными состояниями при мозаичной теломерной экспрессии оказалось результатом конкуренции в отношении экспрессии между «молчащими» и активными генами (Aparicio and Gottschling, 1994; описано в Weintraub, 1993). Если транскрипционный активатор для теломерного гена делегирован, базовый механизм транскрипции этого гена оказывается недостаточным для экспрессии, и этот ген оказывается конститутивно сайленсированным Наоборот, сверхэкспрессия активатора заставляла теломерный ген экспрессироваться постоянно — это ген никогда не был сайленсирован. В отсутствие SIR3 (или SIR2 или SIR4) базальная экспрессия гена была достаточной, тогда как увеличенная доза SIR3 повышала долю клеток, которые были сайленсированы. Хотя транскрипционный активатор мог преодолеть сайленсинг на протяжении всего клеточного цикла, он был наиболее эффективным, когда клетки были остановлены в фазе S — предположительно, когда хроматин реплицируется и, отсюда, оказывается наиболее чувствительным к конкуренции. Несколько удивляет, что клетки, остановленные на G 2/M, также можно было легко переключить, что заставляло предполагать, что «молчащий» хроматин еще не был полностью собран к этому времени.