Британская ассоциация по ветеринарии мелких животных - Руководство по репродукции и неонатологии собак и кошек

Образец фиксируют в формалине и исследуют под фазово-контрастным микроскопом при 1000-кратном увеличении. Дефектами сперматозоидов считают проксимальные включения, дистальные включения, утрату головки, дефекты акросомы, изменения акросомы, изменения тела, удвоение хвостов. К дефектным также относят сперматозоиды, сцепленные хвостами. Кроме того, подсчитывают количество сперматозоидов, не имеющих дефектов.

В окрашенном образце подсчитывают количество лейкоцитов, сперматогенных клеток и дегенеративных эпителиальных клеток (по Папаниколау).

У котов объем эякулята небольшой (до 0,01–0,77 мл). Если сперму собирают с помощью электроэякуляции, то из-за более интенсивной стимуляции добавочных желез ее объем заметно больше, чем при получении с помощью искусственной вагины. Общее количество сперматозоидов в эякуляте составляет от 3 х 10 6до 153 х 10 6, обычно оно выше, когда сперму собирают с помощью искусственной вагины, чем если ее получают методом электроэякуляции. Подвижность сперматозоидов различна и может быть связана с продолжительностью сексуального воздержания. Осмоляльность свежей спермы, собранной с помощью искусственной вагины, составляет около 320 мосм/кг и возрастает при хранении. Сперма содержит много алкалин фосфатазы, ее рН колеблется между 6,6 и 8,77. Содержание нормальных сперматозоидов на уровне 60 % и более считают нормой, при показателе менее 40 % можно говорить о тератозооспермии. Однако связь между качеством спермы и фертильностью у домашних кошек нуждается в дальнейшем изучении. В естественных условиях нормальная фертильность наблюдается и при менее чем 40 % содержании нормальных сперматозоидов в эякуляте. Если сперму получают методом электоэякуляции два раза за короткий промежуток времени, то во втором образце, как правило, отмечается большая подвижность и более высокий процент здоровых сперматозоидов. Был проведен эксперимент: от 15 котов разных пород 2 раза за время одной анестезии брали сперму методом электроэякуляции. Оказалось, что количество здоровых сперматозоидов в первом эякуляте составляет 40,9 %, тогда как во втором возрастает до 54,6 %, притом что первый эякулят отличается более высокой концентрацией. Из изложенного следует, что для определения фертильности целесообразно проводить несколько анализов спермы.

Сперму сохраняют в течение 24–48 часов в охлажденном буферном растворе. Если предполагается длительное хранение, ее замораживают. В большинстве случаев определение параметров спермы после хранения проводят in vitro, хотя данных об успешном оплодотворении кошек спермой, подвергавшейся длительному хранению, немного.

В связи с тем, что качество спермы котов исследуют in vitro, результаты осеменения предсказать трудно. Для хранения спермы при температуре 4–5 °C применяют Test-T буфер (табл. 10.4), содержащий 20 % яичного желтка и 5 % глицерина. Хранение приводит к снижению подвижности сперматозоидов и процентного соотношения неповрежденных акросом. Повышенное содержания желтка и Сахаров снижает подвижность сперматозоидов при хранении, поэтому простой TesT-буфер, не содержащий Сахаров или желтка, вполне пригоден для разбавления спермы.

N-трис-гидроксиметил-метил-2-аминометан-сульфоновая кислота (Tes) — 11,2 г в 150 мл дистиллированной воды;

Трисгидроксиметиламинометан (Tris) — 2,9 г в 75 мл дистиллированной воды;

Пенициллин В — 1000 МЕ/мл;

Стрептомицин — 1 мг/мл.

* Tes доводится до рН 7,4 This буфером. Желток и глицерин добавляют в случае, если раствор предполагается использовать для замораживания спермы (при охлаждении это необязательно).

Деионизированная вода — 76 мл;

Лактоза — 11 г;

Глицерин — 4 мл;

Сульфат стрептомицина — 1000 мг/мл;

Пенициллин G — 1000 МЕ/мл;

Яичный желток — 20 мл.

Сперму котов замораживают в желточно-лактозном буфере (табл. 10.5). Замораживание в гранулах и пайеттах дает сопоставимые результаты в отношении сохранения подвижности сперматозоидов, доли сперматозоидов с неповрежденным акросомами, проникновения через zona pellucida и связывания с оолеммой. Свежую сперму разбавляют раствором Ham's F 10 в соотношении 1:3 (с добавлением 5 % эмбриональной сыворотки телят), центрифугируют, затем смешивают с буфером. Разбавленную сперму помещают в 0,25 мл пайетты, оставляют на 10 минут при температуре 22 °C и на 60 секунд вручную опускают в пары жидкого азота, охлаждают там до -10 °C, после чего замораживают до -100 ºС, понижая температуру со скоростью -40 °C/мин, затем опускают в жидкий азот. Сперму размораживают в течение 10 секунд на воздухе, затем в течение 20 секунд на водяной бане при температуре 37 °C, после чего смешивают с раствором Ham's F 10. Кроме названного раствора, для разбавления спермы применяют буферы TesT и Трис. Подвижность сперматозоидов и количество неповрежденных акросом снижаются после размораживания.

Работы по искусственному осеменению домашней кошки проводятся преимущественно в научных целях, поскольку ее биология имеет сходство с биологией диких кошачьих, однако разработанные методы искусственного осеменения и сохранения спермы могут найти применение в племенном разведении кошек. Численность племенных животных у многих пород ограничена, в частности, из-за того, что большинство котов подвергается кастрации в связи с поведенческими проблемами (например, нанесения мочевых меток), осложняющими их содержание в домашних условиях. Недостаток производителей, а также дисбаланс численности некастрированных кошек и котов рано или поздно приводит к инбридингу и дегенерации, что оборачивается распространением врожденных дефектов и заболеваний. Замораживание спермы позволяет обеспечить не только ее экспорт в любую страну мира, но и возможность получать потомство даже от кастрированных или погибших котов. Кроме того, искусственное осеменение значительно снижает риск распространения заболеваний.

В отсутствие вязки овуляцию стимулируют посредством инъекции человеческого ХГ, повышающего секрецию ЛГ. Индукция овуляции наиболее эффективна на 3 день эструса. Внутримышечное введение 100 ME человеческого ХГ обеспечивает овуляцию у большинства кошек, повышение дозы приводит к гиперстимуляции яичников и дегенерации ооцитов. Анестезия угнетают овуляцию, если проводится после ее индукции или непосредственно перед овуляцией. В качестве альтернативного метода можно использовать внутримышечное введение 25 мкг ГнРГ.