Рудольф Рэфф - Эмбрионы, гены и эволюция

Рис. 11-6.События, происходящие при процессинге гена митохондриального цитохрома b дрожжей. Организация гена представлена на схеме А. Длина его равна примерно 7 килобаз. Элементы кодирующей последовательности показаны черным, а интроны - белым, за исключением интронных мутационных сайтов двух типов. Мутации в заштрихованных участках нитронов блокируют процессинг цитохромной мРНК. Участки, покрытые пунктиром, - мутации, возникшие на границах между кодирующими последовательностями и нитронами. Отдельные стадии процессинга левого конца транскрипта РНК показаны на схемах Б-Д . Сплайсинг первого интрона приводит к образованию РНК, которая функционирует как мРНК для синтеза матуразы, обеспечивающей следующую стадию сплайсинга. Часть матуразной мРНК происходит от интрона box-3. TER - сайт терминации для трансляции матуразы (Lazowska, Jacq, Slonimski, 1980).

Для того чтобы могла образоваться функциональная мРНК для цитохрома b, интронные последовательности должны быть вырезаны из первичного транскрипта и должен произойти сплайсинг кодирующих последовательностей. Оказалось, однако, что процессинг - сложный многоступенчатый процесс. Мутации в интроне гена box-3 нарушают процессинг, потому что этот интрон действительно транслируется, чтобы мог образоваться белок, необходимый для процессинга транскрипта гена box. Последовательность в этом интронном участке, определяющем синтез данного белка, известна, так как этот участок гена box был секвенирован.

Первый этап сплайсинга первичного транскрипта гена box , схематически представленного на рис. 11-6, приводит к образованию РНК, содержащей кодирующую последовательность box-4/5 для цитохрома b , сцепленную с маленьким кодирующим участком у конца интрона box-3. Эта РНК, содержащая кодирующие последовательности для цитохрома b и интронные последовательности, функционирует как мРНК, обеспечивая синтез белка матуразы, необходимого для следующей ступени процессинга. На этом этапе происходит удаление последовательности интрона box-3 , с тем чтобы образовалась мРНК, содержащая только последовательности, кодирующие цитохром b. Подобным же образом интрон box-7 также, по-видимому, продуцирует сходную, хотя и другую матуразу, поскольку мутации box-3 и box-7 комплементарны друг другу. Гипотетическая матураза box-7 , по-видимому, не только участвует в процессинге гена цитохрома b, но необходима также для процессинга транскрипта гена oxi-3, поскольку мутации в интроне box-7 воздействуют на синтез цитохромоксидазы.

Роль процессинга в регуляции генной экспрессии выявляется также в примерах с α-амилазами из печени и слюнной железы мышей. Хагенбюхль и др. (Hagenbuchle et al.) обнаружили, что последовательности мРНК в ферментах печени и ферменте слюнной железы идентичны по своим кодирующим участкам и нетранслируемым 3'-участкам. Однако нетранслируемые 5'-участки этих мРНК различны. Данные названных авторов позволяют предполагать, что эти белки кодируются одним и тем же геном, но что его экспрессия, возможно, регулируется тканеспецифичным процессингом транскриптов. Очевидно, что разорванные гены играют важную роль в регуляции координированной генной экспрессии у эукариот и что существование подобной организации генов делает возможной значительную эволюционную пластичность.

Однажды знаменитого альпиниста Джорджа Маллори спросили, почему ему хотелось взобраться на Эверест. Он ответил: « Потому что Эверест существует ». По-видимому, по такому же принципу в природе происходит выбор точек, которые контролируют биологические процессы. Поскольку регуляция генной экспрессии на уровне сплайсинга наблюдается так часто, возникает соблазн предположить, что у эукариот вся регуляция осуществляется на уровне сращивания ядерных транскриптов. Однако экспрессия многих генов, в частности тех, которые кодируют белки, характерные для клеток с терминальной дифференцировкой, регулируется на уровне транскрипции. Прекрасной иллюстрацией этого служит синтез овальбумина, индуцируемый в яичниках эстрогеном. Руп и др. (Roop et al.), используя меченную изотопами клонированную овальбуминовую ДНК в качестве пробы на транскрипты овальбуминовых генов в ядрах клеток яичников, обнаружили в ткани, стимулированной эстрогеном, примерно по 3000 транскриптов на ядро, а в тканях цыплят, не получивших гормона, - менее 2 на ядро. В подобных легко поддающихся изучению случаях участвуют гены, продуцирующие в ответ на индуцирующий сигнал очень большие количества какого-либо специализированного продукта. Вполне возможно, однако, что экспрессия генов, ответственных за важнейшие решения в процессе развития, также регулируется на уровне транскрипции. На такую мысль наводит поведение при транскрипции пуф - областей в политенных хромосомах, в которых дифференцировка явно связана с дифференциальным характером транскрипции. На это указывают также сроки проявления активности генов, играющих важную роль в развитии. Цитоплазма неоплодотворенных яиц содержит очень разнообразные мРНК, а между тем преобладающее большинство мутаций, наблюдаемых в экспериментах, подобных описанным в гл. 10, проявляются у зародыша, а не передаются по материнскому типу. Очевидно, что активность соответствующих генов приходится на эмбриональный период.

В регуляции генной экспрессии, по-видимому, участвуют локальные регуляторные элементы, либо примыкающие к отдельным генам, либо находящиеся в них самих. Транскрипционные единицы содержат не только кодирующие последовательности и интроны, но также некодирующие последовательности, примыкающие к генам на 5'- и 3'-концах. Существование регуляции на уровне и транскрипции, и процессинга свидетельствует о том, что локальные регуляторные элементы включены в транскрипционные единицы. Некоторые из первичных локальных регуляторных элементов представлены сайтами, которые должны распознавать поступающие извне регуляторные сигналы, специфически индуцирующие или репрессирующие транскрипцию данного гена. В их число входят также: сайт для связывания РНК-полимеразы, сайт, инициирующий транскрипцию; сайт, определяющий окончание транскрипции; сайты, определяющие процессинг; сайты, в которых происходит разрезание и сращивание при процессинге, и сайты внутри самой мРНК, обеспечивающие ее присоединение к рибосоме и начало трансляции.

Существование функционального локального контролирующего элемента, примыкающего к гену, показали генетическими методами Човник (Chovnick) и его сотрудники для локуса rosy у дрозофилы. Локус rosy был первоначально определен как локус, в котором возникает рецессивная мутация, обусловливающая коричневатый цвет глаз. Эта мутантная окраска вызвана недостатком дрозоптерина - пигмента, обусловливающего красный цвет глаз; недостаток пигмента создается отсутствием фермента ксантиндегидрогеназы. Мутации в локусе rosy вызывают структурные изменения белка ксантиндегидрогеназы. Човник и его сотрудники определили протяженность гена ксантиндегидрогеназы, составив карту внутригенных рекомбинаций очень большого числа мутаций в локусе rosy. Существуют также генные изменения, оказывающие влияние на уровень экспрессии этого гена. Одно из них было нанесено на карту как предположительный прилегающий регуляторный элемент, активный в цис -положении. Было установлено, что этот мутантный вариант продуцирует большее количество ксантиндегидрогеназы, чем обычно, и что продуцируемый белок отличается по электрофоретической подвижности. Как показал анализ внутригенных рекомбинантов, регуляторный сайт отделен от «электрофоретического» сайта, находящегося в самом структурном гене ксантиндегидрогеназы. На генетической карте регуляторный сайт лежит на расстоянии, соответствующем 3000 пар нуклеотидов, от одной из границ структурного гена, установленной генетическими методами. Хотя этот мутантный сайт, казалось бы, расположен очень далеко от структурного гена ксантиндегидрогеназы, возможно, что на самом деле сайт инициации транскрипции находится не так уже далеко от мутантного регуляторного сайта. Вполне возможно, что сайт инициации транскрипции по аналогии с ситуацией для генов белков хориона, схематически представленной на рис. 10-7, находится вблизи от регуляторного сайта и отделен от структурного гена, определенного генетическими методами, большим нитроном.