Рудольф Рэфф - Эмбрионы, гены и эволюция

Создание методов клонирования рекомбинантной ДНК и секвенирования ДНК сделало возможным (и модным) поиск локальных регуляторных сайтов в последовательностях ДНК, примыкающих к структурным генам.

Было обнаружено некоторое число потенциальных регуляторных сайтов. Они схематически изображены на рис. 11-7, ни котором показана идеализированная транскрипционная единица млекопитающих и составляющие ее сигнальные последовательности. На этой схеме показана также организация участков, расположенных выше точки начала транскрипции, у рано экспрессируемых генов вируса SV40 млекопитающих и гена, кодирующего гистон Н2А у морского ежа. Оба участка содержат регуляторные сайты, расположенные на 200 пар нуклеотидов выше точки начала транскрипции. Сам структурный ген начинается с сайта инициации, с которого фактически и начинается транскрипция. Этому сайту соответствует 5'-конец мРНК; в мРНК он модифицирован характерным основанием 7-метилG 5'ррр, которое образует кэп, играющий важную роль в трансляции. Инициирующая последовательность, изображенная на рис. 11-7, - это обобщенная последовательность, выведенная путем сопоставления инициирующих последовательностей нескольких генов. На самом деле эти последовательности сильно варьируют. В них имеется несколько внутренних сигнальных последовательностей, в том числе сайт начала трансляции, сигналы сплайсинга на границах между нитронами и кодирующими последовательностями и сайты, определяющие терминацию транскрипции и добавление полиадениловых фрагментов к 3'-концу мРНК.

Рис. 11-7.Сигнальные последовательности, ассоциированные с генами эукариот. Вверху представлена идеализированная транскрипционная единица млекопитающих. ТАТА-блок, который, возможно, участвует в связывании РНК-полимеразы, лежит у 5'-конца гена. Транскрипция начинается с сайта кэпа, который лежит на расстоянии примерно 30 пар нуклеотидов. Кодирующие последовательности показаны черным; единственный показанный на схеме интрон покрыт пунктиром. К внутренним сигналам относятся сайты сплайсинга и сайты терминации и аденилирования. На схеме раннего промоторного участка вируса SV40 показаны две последовательности из 70 пар оснований (заштрихованы), расположенные на расстоянии 116 нуклеотидных пар от сайта начала транскрипции в сторону 5'-конца. Эти последовательности необходимы для экспрессии раннего участка вируса SV40 in vivo . На нижней схеме показана начальная область (с 5'-конца) для одного из членов кластера гистоновых генов морского ежа. Участок А содержит эволюционно консервативную последовательность, участок В - ТАТА-блок, а участок С - сайт кэпа. Воздействие делений этих участков на транскрипцию рассмотрено в тексте. (Lewin, 1980; Benoist, Chambon, 1981; Mathis, Chambon, 1981; с изменениями. Grosschedl, Birnstiel, 1980.)

Особый интерес для понимания регуляции транскрипции генов в процессе развития представляют, однако, регуляторные сайты, расположенные выше точки начала транскрипции. Наиболее хорошо известна последовательность ТАТАААА (ТАТА-блок, или ТАТА-бокс), лежащая на расстоянии примерно 30 пар нуклеотидов от точки начала транскрипции. Эта последовательность очень сходна с сайтом узнавания РНК-полимеразы, впервые обнаруженным Прибновом (Pribnow) у бактерий и необходимым для транскрипции бактериальных генов. ТАТА-блок необходим для транскрипции генов эукариот в системе in vitro , но, как показали эксперименты, проведенные недавно Бенуа и Шамбоном (Benoist, Chambon), Матисом и Шамбоном (Mathis, Chambon) и Гросшедлом и Бирнстилом (Grosschedl, Birnstiel), при транскрипции in vivo в ТАТА-блоке нет необходимости. Если ввести в ооциты Xenopus клонированные гены, они точно транскрибируются. Можно вызвать делеции определенных участков и ввести в ооциты такие модифицированные гены. При этом можно определить как скорость транскрипции, так и последовательность образующейся РНК. Путем таких экспериментов было установлено, что гены, из которых был удален ТАТА-блок, транскрибируются почти с такой же скоростью, как обычно, но что транскрипция инициируется в нескольких сайтах, которые в нормальных генах не используются. Таким образом, последовательность ТАТА определяет сайт инициации, с которого РНК-полимераза начинает транскрипцию; однако этот сайт не является абсолютно необходимым для связывания РНК-полимеразы или для начала транскрипции.

На самом деле модуляция транскрипции зависит от регуляторных сайтов, расположенных на целых 200 пар нуклеотидов выше сайта инициации транскрипции. Бенуа и Шамбон обнаружили, что у вируса SV40 этот участок имеет сложную структуру. Он содержит пять блоков, богатых GC-последовательностями. Два из этих блоков включены в две тандемно повторяющиеся последовательности, состоящие из 72 пар нуклеотидов каждая и расположенные примерно на 150 пар нуклеотидов выше сайта начала транскрипции. Эксперименты, в которых эти тандемные последовательности удаляли из ДНК, показали, что они необходимы для транскрипции in vivo .

У гена, кодирующего гистон Н2А морского ежа Psammechinus miliaris, также имеются регуляторные последовательности, удаленные от сайта инициации. Участок гена Н2А, расположенный вверх от точки начала транскрипции (рис. 11-7), можно разделить на несколько различных функциональных участков. Участок С содержит сайт инициации. На расстоянии примерно 30 пар нуклеотидов от сайта инициации в участке В имеется ТАТА-блок. На расстоянии примерно 35 пар нуклеотидов от ТАТА-блока, находится участок А, содержащий последовательность из 30 нуклеотидов, несущую на каждом конце короткие инвертированные последовательности. Эта последовательность из 30 нуклеотидов специфична для гена Н2А и эволюционно консервативна. Участок Ε начинается с 110-й пары нуклеотидов выше сайта инициации и тянется дальше еще на 340 пар нуклеотидов. Этот сегмент богат АТ-парами.

Гросшедл и Бирнстил провели испытание функциональной роли каждого из участков, лежащих выше точки начала транскрипции, сравнивая транскрипцию клонированных генов Н2А, несущих делеции в этих участках, с транскрипцией немодифицированных клонов Н2А. Делеция участка, содержащего ТАТА-блок, вызывала понижение скорости транскрипции гена Н2А в 5 раз и приводила к тому, что транскрипция начиналась с новых сайтов инициации. Делеция консервативного блока из 30 пар нуклеотидов в участке А привела к ускорению транскрипции вдвое. Делеция большого участка Е, богатого АТ-парами, привела к замедлению транскрипции гена Н2А в 15-20 раз. Регуляторная функция этого участка может определяться либо его составом, либо наличием в нем какой-то специфической последовательности. Для проверки этих гипотез Гросшедл и Бирнстил создали модифицированный клон, содержащий участок Е, но с инвертированной последовательностью. Проверка на транскрипцию дала неожиданный результат: у ДНК, содержавшей инвертированный участок, уровень транскрипции оказался в 5 раз выше. Наряду с образованием обычных Н2А-транскриптов образовывались и транскрипты, на 5'-конце которых имелся добавочный фрагмент длиной в 90 нуклеотидов.