Наталья Стволинская - Цитология

Живые клетки бесцветны и прозрачны. Их показатель преломления близок к показателю преломления окружающего раствора. Поэтому неокрашенные клетки трудно рассматривать под микроскопом. В начале XIX в. ученые стали использовать цветные красители, которые делали клеточные структуры более контрастными и видимыми в световой микроскоп. Сейчас таких красителей множество. Некоторые из них преимущественно окрашивают определенные клеточные органеллы. Наиболее часто используемые красители для выявления общей морфологии клеток – это гематоксилин и эозин. Гематоксилин имеет сродство к отрицательно заряженным молекулам, поэтому выявляет распределение в клетках дезоксирибонуклеиновой кислоты и кислых белков. Обработка клеток гематоксилином приводит к выявлению структур ядра: хроматина, хромосом, ядрышка. Эти структуры окрашиваются в сине-фиолетовые цвета. После гематоксилина препарат помещают в раствор эозина, который окрашивает все остальные структуры клетки в розовый цвет. На розовом фоне цитоплазмы будет четко видна контрастная фиолетовая структура ядра.

Наибольшие успехи в описательной цитологии были достигнуты, когда в XIX в. научились делать постоянные, длительно хранящиеся окрашенные препараты клеток и тканей. Приготовление таких препаратов трудоемко и включает ряд этапов. Первый этап – взятие материала для исследования и фиксация небольшого кусочка ткани (0,5 см 3). Цель этого процесса – быстро законсервировать клетки, но предотвратить распад клеточных структур. Чаще всего в качестве фиксаторов для световой микроскопии используют формалин, спирт, пикриновую кислоту, смеси формальдегида с этиловым спиртом, хотя известны сложные смеси многокомпонентных фиксаторов.

После фиксации из кусочка ткани нужно приготовить тонкие срезы толщиной 5–10 мкм на специальном приборе микротоме с помощью очень острого металлического ножа (лезвия). Чтобы срезы получились тонкими, кусочек ткани после фиксации обезвоживают с применением серии спиртов повышающейся концентрации и ксилола, затем пропитывают расплавленным парафином при 56ºС. При комнатной температуре парафин застывает, и кусочек ткани становится твердым, он готов для приготовления срезов.

Приготовленные срезы помещают на предметное стекло, растворяют парафин ксилолом, постепенно замещают ксилол водной средой с помощью растворов этилового спирта убывающей концентрации. Затем препарат окрашивают в водном растворе красителя. После окрашивания препарат опять обезвоживают и заключают в каплю канадского бальзама под покровное стекло. Такой препарат может храниться очень долго, на протяжении нескольких лет.

Совокупность приемов и методов приготовления и анализа с помощью световой микроскопии называется микротехникой.

В XX в. были разработаны световые микроскопы, позволяющие более детально изучать живые неокрашенные клетки. Это интерференционная микроскопия, поляризационная микроскопия, разнообразные приставки к обычному световому микроскопу – фазово-контрастная микроскопия и метод темного поля.

При изучении живых клеток широко используется люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия. В люминесцентном микроскопе объект освещается ультрафиолетовым лучом, используются особые красители – флюорохромы, которые при поглощении энергии света начинают ярко флюоресцировать. Флюорохромы могут избирательно связываться с определенными структурами клетки или макромолекулами. При таком микроскопировании светящиеся клеточные структуры выявляются на темном фоне. Разрешающая способность люминесцентного микроскопа такая же, как в световом.

Вопросы

1. Какой размер имеют клетки?

2. Перечислите компоненты микроскопа, задействованные в построении изображения. Какую функцию они выполняют?

3. Что такое разрешающая способность светового микроскопа?

4. Что такое микротехника?

5. Для чего используется фиксация? Приведите примеры фиксаторов.

6. Перечислите этапы приготовления постоянных препаратов.

Развитие световой микроскопии и техники приготовления препаратов позволило в тридцатых годах XIX в. сформировать представление о таких клеточных компонентах, как протоплазма и ядро. Впервые это обсуждается в работах Я. Пуркинье и Р. Броуна. Чуть позже немецкий ботаник М. Шлейден обобщил накопленные данные о сходстве строения клеток растений. Он высказал гипотезу о том, что все растения состоят из клеток, ошибочно считая, что клетки растений образуются путем кристаллизации жидкости вокруг ядра, и появление клеточной структуры растения связано с его жизнедеятельностью.

В 1838 г. Т. Шванн обобщил данные о клеточном строении и растений, и животных и сформулировал представление о клетке как структурной единице всех живых организмов. Он писал: «Клетки – это организмы, а растения и животные представляют собой агрегаты этих организмов, построенные по определенным законам». Вместе с тем и Шлейден, и Шванн ошибались, считая, что клетки могут образовываться из бесструктурного вещества, а главной структурой, которая обеспечивает особенности клетки, является клеточная оболочка.

По мере развития техники микроскопирования накапливались данные о развитии живых организмов, и во второй половине XIX в. не подтверждается представление о возможности образования клеток из бесструктурного вещества. Наоборот, утверждается представление немецкого микроскописта и патологоанатома Р. Вирхова о том, что всякая клетка происходит от клетки путем деления предшествующей, рост организма происходит за счет деления клеток.

Таким образом, в 50-е гг. XIX в. клеточная теория была представлена тремя положениями: 1) клетка – элементарная минимальная единица жизни; 2) каждая клетка происходит из себе подобных; 3) организм представляет собой совокупность клеток.

К концу XIX в. в связи с усовершенствованием микроскопов и микроскопической техники складывается представление о сложной организации клеток; двух процессах клеточного деления – митозе и мейозе, особенностях и значении этих процессов; закладываются знания о процессе оплодотворения.

В XX в. у исследователей появляются совершенно новые методы, которые позволяют изучать не только морфологию клеток, но и сложные этапы метаболизма. При помощи этих методов удалось связать структуру органоидов клетки с функцией, которую они выполняют. Это методы специфического окрашивания различных классов крупных клеточных молекул, методы слежения за структурными компонентами биополимеров в метаболических путях клетки. Развиваются биохимические подходы, активно изучается метаболизм клетки. В 30-е гг. XX в. на разных объектах растительного и животного происхождения показывается общность метаболических путей. И в эти же годы формируется представление о том, что единство клеточных структур основано не только на морфологии, но и на единстве химической организации, единстве всех процессов метаболизма.