Коллектив авторов - Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

Важным моментом является правильное иссечение объектов, предназначенных для фиксации и дальнейшего гистологического исследования. Кусочки органов следует вырезать острым ножом или бритвой. Не рекомендуется пользоваться ножницами во избежание травмирования объектов. Нельзя сдавливать кусочки, скоблить или протирать их поверхность, особенно слизистую и серозную оболочки.

Для микроскопического исследования вырезают кусочки органов толщиной 0,5 – 1,0 см. Длина и ширина могут быть различными (обычно 1,0 × 1,5 см). При этом стараются сформировать объект с таким расчетом, чтобы получаемый срез поместился на стандартное предметное стекло. Ввиду медленного проникновения фиксатора в глубину ткани не рекомендуется брать для исследования более толстые кусочки. Кусочки сразу же помещают в фиксирующую жидкость. Недопустимо обмывание кусочков водой перед фиксацией (это может привести к удалению объектов, имеющих диагностическое значение, и появлению артефактов).

Световая микроскопия– микроскопия в проходящем свете видимого спектрального диапазона с использованием способности различных компонентов гистологического препарата к селективному восприятию биологических красителей. Для того чтобы структуры, наблюдаемые в микроскоп, хорошо сохранялись при обработке иссеченного материала, необходимо сделать их устойчивыми к действию применяемых при проводке и окраске химических реагентов. Подобная устойчивость структур, а также уплотнение материала достигаются в ходе фиксации. Фиксация необходима и для максимального сохранения внутриклеточных и тканевых взаимоотношений, только при этом условии можно получить информативные препараты для диагностических и исследовательских целей.

Существуют физические и химические способы фиксации. К первым относятся действие высокой температуры и влияние электромагнитного излучения в сверхвысокочастотном диапазоне (микроволновая фиксация). В настоящее время высокотемпературная фиксация применяется редко. По С. С. Вайлю, кусочки нефиксированной ткани помещают в кипящую воду на 1 – 3 мин, после чего переносят в 90 – 100 %-й этанол и после обезвоживания заливают в парафин. Р. Лилли (1969) рекомендует использовать для варки изотонический раствор хлорида натрия (0,85 – 0,90 %) и изготавливать срезы на замораживающем микротоме без заливки. В этом случае препарат можно получить через несколько минут после доставки срочной биопсии. К возникающим артефактам относят сильное сморщивание тканей и разрушение нежных структурных образований (Вайль С. С., 1934).

Микроволновая фиксация осуществляется при помощи современных лабораторных установок, позволяющих контролировать температуру обрабатываемого объекта. Преимущество этого метода перед другими способами фиксации состоит в мгновенном проникновении фиксирующего фактора во все части объекта. Экспериментальными исследованиями установлено, что оптимальная температура при микроволновой фиксации составляет 45 – 55 °C. Перегрев объекта до температур выше 65 °C ведет к появлению артефактной вакуолизации цитоплазмы и пикнотизации ядер клеток. Данный метод фиксации рекомендован при проведении срочных биопсий (Bancroft J. D. [et al.], 2002).

Химические методы фиксации основаны на влиянии на тканевые структуры различных химических веществ (спиртов, альдегидов, кетонов, кислот, солей), которые, проникая в фиксируемый материал, вызывают многообразные физико-химические процессы, приводящие к стабилизации его структуры. Различают простые и сложные (составные) фиксаторы. К первым могут быть отнесены ацетон, этанол, метанол, формалин, тетраоксид осмия. Вторая группа намного более разнообразна и включает сотни различных составных фиксирующих растворов, обладающих различными преимуществами и недостатками.

Ацетон как самостоятельное фиксирующее вещество редко применяется в гистологии из-за сильного сжатия фиксируемого материала. Тем не менее его нередко используют для фиксации цитологических мазков и криостатных срезов, выполненных из нефиксированного материала. Считается, что кратковременная фиксация ацетоном (15 мин) позволяет сохранить часть антигенов, которые разрушаются при других способах фиксации и последующей заливке объектов в парафин. По мнению Б. Ромейса (1954), фиксация чистым ацетоном имеет смысл лишь при необходимости быстрого получения гистологического препарата. Для этого кусочки органов толщиной 1 – 3 мм помещают на 1 – 3 ч в безводный ацетон, переносят на 30 мин в ацетон-бензол (1: 1), затем на 30 – 60 мин в бензол и заливают в парафин. Непосредственный перенос объектов из ацетона в парафин нежелателен, так как последний почти нерастворим в ацетоне.

Для фиксации тканей применяют как чистый этиловый спирт, так и различные смеси этанола и других веществ. В практической работе этанол следует применять при фиксации нервной ткани для окраски по Нисслю и при планировании выявления гликогена. В сравнении с формалиновой спиртовая фиксация дает лучшие результаты и при выявлении железа, бактерий, амилоида. В отличие от формалина спирт обладает меньшей проникающей способностью, поэтому для фиксации берут кусочки не толще 0,5 см.

Фиксирующее действие спирта основано, прежде всего, на удалении воды из тканей – обезвоживании. Этот процесс сопровождается коагуляцией белков без существенного нарушения их антигенной структуры. Согласно Б. Ромейсу (1954), в этаноле полностью сохраняется ряд веществ, которые в других жидкостях растворяются целиком или частично. К таким веществам относятся муцины, гликоген, мочевая кислота, железо, кальций. Напротив, жиры и жироподобные вещества, холестериновые соединения растворяются и экстрагируются. В результате потери воды и липидов цитоплазма сильно сморщивается, причем больше, чем ядро клетки. Несмотря на этот недостаток, фиксация спиртом остается незаменимой для многих специальных исследований.

Обычно этанол промышленного производства, доступный для использования в гистологических целях, соответствует двум категориям:

– ректификат , который представляет собой очищенный перегонкой в производственных условиях 95,5 %-й этанол (96 %-й медицинский спирт);

– абсолютный спирт , получаемый в результате ректификации смеси спирта, воды и бензола. Вначале тройной азеотроп указанных компонентов отгоняется до полного удаления воды, затем азеотроп спирта и бензола – до полного удаления бензола.

Получение из 96 %-го этанола абсолютного спирта в лабораторных условиях весьма затруднительно, поэтому авторы не рекомендуют использовать описанные в литературе методики с прокаливанием медного купороса (из-за низкого качества получаемого спирта) и способы с применением негашеной извести и металлического кальция (из-за высокой пожароопасности). В настоящее время денатурированный абсолютный этанол поставляется многими ведущими фирмами – производителями химических реагентов для лабораторных исследований, его могут приобрести организации, имеющие соответствующую лицензию.