Коллектив авторов - Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

Для изучения гистологических препаратов плотных кальцифицированных тканей могут быть изготовлены шлифы, которые позволяют сохранить минеральные компоненты, придающие тканям высокую плотность. Однако эта процедура трудоемка и требует специального оборудования. На обычном микротоме невозможно изготовить срезы недекальцинированной костной ткани. Перед заливкой таких объектов в парафин или целлоидин производят декальцинацию, в ходе которой из объекта удаляются соли кальция, он теряет свою плотность и становится пригодным для последующей микротомии. Как правило, декальцинацию проводят после полной фиксации ткани. Однако существуют методы, благодаря которым декальцинация начинается одновременно с фиксацией. В этом случае фиксирующая среда должна содержать декальцинирующее вещество. После декальцинации в кислотах желательна тщательная промывка материала в слабощелочных растворах на протяжении 1 – 3 ч.

В литературе указывается много прописей различных декальцинирующих составов. Наиболее часто употребляемые из них приводятся в руководстве В. В. Некачалова (2000). При необходимости для декальцинации может быть использован раствор любой кислоты. Вместе с тем необходимо учитывать:

– простоту изготовления применяемых декальцинирующих растворов, безопасность для работы;

– скорость выполнения декальцинации;

– возможное повреждающее действие декальцинирующего раствора на костную ткань;

– оценку качества и информативности для анализа изготовляемых гистологических препаратов;

– возможность длительного хранения гистологических препаратов в архиве.

При декальцинации ткани, содержащей много жира (губчатой костной ткани пожилых людей, костного мозга и т. п.), ее необходимо обезжиривать, выдерживая объект 3 – 5 дней в 80 – 90 %-м этаноле (лучше в термостате при температуре 37 °C).

Азотная кислота.В мензурку с притертой пробкой наливают 5,0 – 7,5 мл химически чистой концентрированной азотной кислоты (плотность 1,40) и добавляют до 100 мл дистиллированную воду. Небольшие кусочки самой плотной кости при этом декальцинируются в растворе азотной кислоты уже через 10 ч. После декальцинации для предотвращения набухания соединительной ткани кусочки кости на 24 ч подвешивают в 5 %-м растворе сульфата натрия или лития и после этого промывают в течение 24 – 48 ч в проточной воде. Кислота применяется только для очень плотных объектов, в частности зубов. Используется только 5 – 7 %-й водный раствор азотной кислоты. Не рекомендуется применять растворы азотной кислоты как более низкой, так и более высокой концентрации: в первом случае происходит набухание, во втором – повреждение клеточных структур.

Трихлоруксусная кислота.Применяют 5 – 10 %-й водный раствор этой кислоты, который одновременно фиксирует материал. К раствору целесообразно добавлять 10 – 20 %-й раствор формалина. Декальцинацию в трихлоруксусной кислоте рекомендуется проводить после предварительной фиксации в формалине, жидкости Буэна. Для декальцинации небольших кусочков достаточно 1 – 4 дней. Материал промывают в 96 %-м спирте в течение 3 – 4 дней, ежедневно меняя его. Для промывки нельзя использовать воду, иначе произойдет очень сильное набухание соединительной ткани.

Жидкость Дженкинса.Состав: 4 мл концентрированной соляной кислоты, 3 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл дистиллированной воды, 73 мл 100 %-го спирта и 10 мл хлороформа. Кусочки костной ткани декальцинируются в этом растворе 2 – 4 сут при 20 °C.

После декальцинации материал промывают в двух порциях абсолютного спирта, меняя его каждые 4 ч. Перед заливкой в парафин или целлоидин спирт удаляют, промывая объекты в 2 порциях хлороформа (по 3 мин). После декальцинации в жидкости Дженкинса не происходит набухания коллагеновых волокон, срезы костной ткани хорошо окрашиваются.

Жидкость Рихмана – Гельфанда – Хилла.Декальцинирующая жидкость состоит из 100 мл 90 %-й муравьиной кислоты, 80 мл 38,8 %-й соляной кислоты (удельный вес 1,19) и 820 мл дистиллированной или водопроводной воды. Объем декальцинирующей жидкости должен значительно превышать объем декальцинируемого объекта (в 10 – 20 раз). Небольшие кусочки компактной кости (1 – 2 г) декальцинируются при температуре 24 °C за 12 – 24 ч. В практической работе (за исключением декальцинации зубов) ее можно рекомендовать как мало меняющую тинкториальные свойства тканей и не вызывающую их набухания.

При проведении иммуногистохимического исследования необходимо использовать более мягкие (или щадящие) методы декальцинации, поскольку быстрая декальцинация в растворах кислот приводит к изменению тканевых антигенов и появлению артефактов. Поскольку декальцинирующие растворы, применяемые при иммуногистохимических исследованиях, медленно удаляют соли кальция из объектов, продолжительность декальцинации существенно увеличивается и может быть сокращена только при уменьшении объема декальцинируемого объекта.

Декальцинацию для иммуногистохимии проводят в течение 5 – 30 сут в зависимости от объема и плотности костной ткани. В процессе декальцинации раствор желательно сменить несколько раз.

Фиксатор-декальцинатор формалин/этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).Состав: EDTA, динатриевая соль – 5,5 г; дистиллированная вода – 90 мл, формальдегид (37 – 40 %) – 10 мл. В этом растворе объекты можно не только декальцинировать, но и фиксировать, если для дальнейшего исследования пригодна формалиновая фиксация.

Декальцинирующий водный раствор EDTA.Состав: EDTA, динатриевая соль – 250 г, дистиллированная вода – 1750 мл. Этот раствор имеет pH 7,0 – 7,4. Если раствор мутный, нужно довести рН до 7,0 с помощью NaOH. При этом раствор должен стать прозрачным. Раствор используется после предварительной фиксации объектов.

Декальцинация маленьких объектов(Merchan-Perez А. [et al.], 1999).. Состав: аскорбиновая кислота – 1 г, хлорид натрия – 0,85 г, дистиллированная вода – 100 мл. Декальцинация этим раствором рекомендована при иммуногистохимическом изучении малых фрагментов костной ткани структур внутреннего уха (Merchan-Perez А. [et al.], 1999). Этот декальцинирующий раствор готовится непосредственно перед использованием и не может долго храниться.

Контроль за ходом декальцинации осуществляют в сочетании с заменой декальцинирующей жидкости. При использовании в качестве декальцинаторов слабых кислот тестирование на завершение декальцинации обычно проводят ежедневно. Для контроля последнего используют различные тесты (Некачалов В. В., 2000). Наиболее простыми являются пробный надрез, прокалывание кусочка препаровальной иглой . Для выполнения тестов требуется некоторый практический опыт, так как ни один из тестов не может быть признан удовлетворительным.