Коллектив авторов - Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

Метанол-уксусная кислота. В последнее время большое распространение получил фиксатор, состоящий из метанола и уксусной кислоты в соотношении 3: 1 (мета-Карнуа). Он рекомендован для фиксации объектов, в которых планируется выявлять аргентофильные белки ядрышкового организатора (Ag-NOR). Сроки фиксации аналогичны срокам, рекомендованным для жидкости Карнуа (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Р. Лилли (1969) приводит сведения о фиксаторе метанолхлороформ (2: 1; время фиксации – 12 – 48 ч), который рекомендуется для экстракции липидов из нервной ткани при комбинированной заливке в целлоидин-парафин. При использовании метанол-хлороформа возможно получение срезов толщиной 2 мкм.

Изопропанол не применяется в гистологии в качестве самостоятельного фиксирующего вещества в связи с плохим проникновением в ткани. Однако он может быть использован в комбинации с другими веществами в составе сложных фиксаторов. В качестве примера можно привести жидкость Ньюкомера и цинк-ацетонизопропанол-формальдегид (Коржевский Д. Э. [и др.], 2006).

Жидкость Ньюкомера дает примерно такие же результаты фиксации, как и жидкость Карнуа. Этот фиксатор состоит из 60 мл изопропанола, 30 мл пропионовой кислоты, 10 мл ацетона и 10 мл диоксана. Образцы тканей следует фиксировать 12 – 24 ч при комнатной температуре и затем хранить при 3 °C в свежей порции фиксатора. Для промывки после фиксации и обезвоживания следует использовать изопропанол (Лилли Р., 1969).

Уксусная кислота сама по себе употребляется для фиксации очень редко, так как в чистом виде она дает плохие результаты. Очень часто ее прибавляют к другим фиксирующим жидкостям. Ледяной уксусной кислотой называют 100 %-ю уксусную кислоту, концентрированная уксусная кислота содержит 4 % воды. Фиксирующее действие уксусной кислоты распространяется в основном на структуры клеточного ядра и хромосомы.

Уксусная кислота – орсеин. 1 г орсеина растворяют в 45 мл горячей уксусной кислоты, охлаждают и добавляют 55 мл дистиллированной воды. Полученный реактив обладает одновременно фиксирующими и окрашивающими свойствами. Он хорошо окрашивает гетерохроматин и хромосомы в цитологических препаратах (Лилли Р., 1969).

Формалин – наиболее распространенная и универсальная фиксирующая жидкость. Формалин хорошо проникает в ткани и потому применяется для фиксации довольно крупных объектов. Формалин придает ткани плотность, вполне подходящую для резки на замораживающем микротоме и вибратоме. Существенное преимущество формалина состоит в том, что препараты можно хранить в нем годами, у них сохраняется способность к окрашиванию наиболее часто используемыми методами (гематоксилинэозином, по Ван-Гизону). Особенно ценной является способность формалина хорошо сохранять липиды, что важно для фиксации нервной ткани. Фиксация чистым формалином менее пригодна для различных цитологических исследований, например для ядерных структур, для органов кроветворения, для обнаружения гликогена или железа. Недостатками формалина являются:

– ухудшение окраски тканей при продолжительной фиксации и хранении «влажного архива»;

– возможность выпадения формалиновых осадков;

– сильное маскирующее действие на большинство антигенов, выявляемых иммуноцитохимически.

Для приготовления формалинового фиксатора используют готовый 35 – 40 % водный раствор формальдегида (альдегида муравьиной кислоты). Следует учитывать, что концентрированный раствор формальдегида обычно содержит метиловый спирт (около 10 %), который добавляют для стабилизации раствора и предотвращения полимеризации формальдегида. Формалин следует хранить в защищающих от света коричневых склянках при температуре не ниже 9 °C. При более сильном охлаждении в растворе появляется муть, которая постепенно оседает в виде белого осадка (параформальдегид и триоксиметилен). При длительном хранении раствор формальдегида медленно окисляется, происходит накопление муравьиной кислоты.

В большинстве случаев препараты удовлетворительного качества можно получить при использовании в качестве фиксирующей жидкости обычного (кислого, не нейтрализованного) 10 %-го формалина. Его готовят из концентрированного раствора формальдегида, добавляя к одной его части 9 частей водопроводной воды. Не следует использовать формальдегид с белым осадком. Часто рекомендуемый способ растворения осадка путем нагревания в вытяжном шкафу на практике мало применим. При появлении незначительного осадка в емкости с концентрированным раствором формальдегида следует уменьшить его разведение (1: 6 вместо 1: 9). При наличии значительного осадка раствор формальдегида становится непригодным для использования (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Определение концентрации формалина в растворе представляется затруднительной задачей. Существующий метод титрования описан у Б. Ромейса (1954), однако он чрезвычайно сложен и поэтому не может быть рекомендован для практических целей. Упростить решение этой задачи позволяет специальная индикаторная бумага, выпускаемая фирмой Sakura (Япония).

При необходимости использования нейтрального раствора формалина (для фиксации нервной ткани, при применении специальных окрасок, при проведении иммуноцитохимического исследования) его готовят следующим образом: раствор формальдегида (37 – 40 %) – 100 мл, вода дистиллированная – 900 мл, однозамещенный фосфат натрия – 4 г, безводный двузамещенный фосфат натрия – 6,5 г. Этот раствор стабилен при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Использование нейтрального формалина позволяет существенно уменьшить вероятность отложения формалиновых осадков, появление которых обусловлено взаимодействием гемоглобина с кислыми растворами формалина (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Нейтрализация формалина по Б. Ромейсу. Формалин оставляют надолго в коричневой склянке над слоем порошкообразного углекислого кальция толщиной 1 – 2 см. Вначале склянку несколько раз энергично взбалтывают. Обычно кислота достаточно нейтрализуется уже через 24 ч.

Если нейтрализация формалина не производится, то его следует развести до нужной концентрации заранее, а не в день фиксации. Этот прием улучшает качество фиксации.

Кусочки органов толщиной 0,5 – 1,0 см фиксируются в 10 – 20 %-м растворе формалина в течение 24 – 48 ч. Спустя сутки раствор меняют. Более длительная фиксация нежелательна. Критерием достаточной фиксации служит равномерное уплотнение объекта как с поверхности, так и выявляемое на контрольном разрезе. В центральной части не полностью фиксированных кусочков ткань сохраняет красно-розовый цвет. Фиксацию в формалине проводят при комнатной температуре (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).